核酸的物理化学性质

核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA 的核糖上有2’－OH，在碱作用下形成磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2’，3’ －环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2’－核苷 酸和3’－核苷酸。
DNA一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加 热至100℃ 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷 酸。
ON H
pK1' 9.5 N-
H
ON H
O
NH
ON H
O
CH3
CH3
pK1' 9.9 N-
H
ON H
NH2
NH2
NH2
HN+ N
N pK1' 4.15 N H
NH
O NH+
HN
H2N
N
NH
N
pK
' 2
9.8
N
NH
H
O
pK1' 3.2
HN
H
H2N
N
N N
N
N-
N
pK2' 9.6
H
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
3、变性因素
高温（一般＞75℃）— 热变性 强酸、碱 — 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAGE中DNA ）
4、变性后理化性质变化
OD260增高 比旋度下降
粘度下降 浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失
• 减色效应（低色效应） —— 复性时紫外吸收减少的现象
(三) 核酸的杂交
变性
不同来源的 DNA分子
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
Southern杂交 Northern杂交 Western杂交
一、核酸的水解
核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键， 其中糖苷键更易被水解。
5′端 C
A
G 3′端
核酸的酸水解
嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳 定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷 键。DNA在pH1.6于37℃对水透析可完全除去嘌呤 碱；在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。
3.判断DNA是否变性
四、核酸的变性、复性与杂交
(一) 核酸的变性（denaturation）
1、DNA的变性：
在某些理化因素作用下，DNA双链解 开成两条单链的过程。
2、变性的实质
某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变
核酸的酶水解
水解核酸的酶种类很多。非特异性水 解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒 磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解 核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有 非特异水解糖苷键的糖苷酶。
核酸酶的分类Ⅰ
➢按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶 （ ribonuclease ，RNase） ； 作 用 于 DNA 的 称 为 DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
具有芳香环结构特点 • 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 • 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性
______主要是环内氨基的贡献
胞嘧啶中
NH2 HN+
ON H
NH2
pK1' 4.6 N H
ON H
NH2
pK
' 2
12.5
N
H
O- N H
尿嘧啶及胸腺嘧啶中
O
O
NH
A260作图，所得的曲线称为解链曲线。
➢ Tm：DNA变性时，OD260达 到最大值的50%时的温度称 为DNA的解链温度或融解温 度(Tm)。
➢大小与G+C含量成正比。
• 指增色效应达50%时的温度
• 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间
Tm值大小与下列因素有关：
（1）DNA的均一性： （2）G－C含量：
RNA变性：从螺旋到线团之间的转变
RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显
完全变性后核酸紫外吸收值增加： • 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% • 实质：碱基暴露
由于变性或降解引起紫外吸收增加的现 象称增色效应
DNA变性
5、DNA热变性的特征
变性过程是“跃变式”的，而非渐 变
➢解链曲线：连续加热DNA，以温度对
经验公式： XG+C＝（Tm－69.3）×2.44
（3）介质中的离子强度：
(二)核酸的复性（renaturation）
• 变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的 单链重新缔合成双链——复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。
DNA复性
• 分子量越大复性越难； • 浓度越大，复性越容易； • DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DNA，复性快）。
NH
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
O
N-
NH+
pK3' 12.4
N-
N
H2N
N
H
NH
H2N
N
N-
2、核苷的解离
•戊糖可增强碱基的酸性解离 •核糖中的羟基也可发生解离
3.核苷酸的解离
•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
RO
O
pK1' 0.7
OH
O
O
P
O-
pK2' 5.9 6.5
➢按 对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶 （ endonuclease ） 和 核 酸 外 切 酶 （ exonuclease ） 。 少数核酸酶既可内切又可外切。
核酸酶的分类Ⅱ
核酸外切酶有5’→3’方向切割的，也有3’→5’方向 切割的，分别称为5’→3’外切酶和3’→5’外切酶。 还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如:限制 性核酸内切酶
（P）＝ 30.98 A
WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
• OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量
– OD260=1.0相当于 • 50μg/ml双链DNA • 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
2.判断核酸样品的纯度
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低
R
H
OH
O O P O-
O-
CH2 O N
-
OH
O
O P OH
O
CH2 O
N
pK1' 1.5 H
CH2 O
N
-
OH
O
O P O-
O
CH2 O
N
OH
OH
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸。