多杀菌素培养基配方的优化

因素的最优水平分别为 Ａ１、Ｂ２、Ｃ１。结合第一次正交实 验结果，可得出优化配方，即葡萄糖 ３２、糊精 ６０、酵母
粉 ２５、玉米浆 １５，ＫＨ２ＰＯ４ １．０，ＣａＣＯ３ ２．０，ＭｇＳＯ４ ０．１。 2. 3 验证实验
将优化配方与原配方进行对比，结果见表 ５。
表5
培养基配方
相对效价 ／％
优化配方
１１７．１
如下趋势：含量较低时与效价呈正相关，含量达到一
定程度时与效价呈负相关。葡萄糖对效价的这种影响
应与其阻遏效应有关［５］，而酵母粉对效价的影响则是
因为其含量过高引起发酵液粘度过大，影响发酵液溶
氧水平，导致效价降低。淀粉和玉米浆对效价有一定
程度的影响，其含量达到一定程度后，对发酵过程影
响减弱，考虑到发酵液粘度及总体的氮源强度，其含
量不宜过高。
３．３ 通过正交实验虽然使多杀菌素发酵水平有所提
高，但其发酵水平仍然偏低，一方面应继续筛选原材
料，进行培养基优化；另一方面应进行菌种选育以提
高菌株自身产抗生素能力。
[ 参 考 文 献]
［１］向双云，周珍辉，宋 渊，等．新型生物农药—— —多杀菌素［Ｊ］．现代
生物医学进展，２００８，８（９）：１ ７５０－１ ７５２．
表 4（续）
因素水平
实验号 Ａ
Ｂ
Ｃ
相对效价 ／％
９
４８
７５
３０
１０６．０
Ｙ１ １１１．４ １０６．６ １１０．５
－
Ｙ２ １０８．６ １０９．５ １０８．８
－
Ｙ３ １０５．０ １０８．８ １０５．６
－
Ｒ ６．４
２．９ ４．９
－
由表 ４ 实验结果可知，各因素对效价影响程度排
序为葡萄糖＞酵母粉＞糊精，同第一次实验一致；各
［２］胡旭华．多杀菌素产生菌的诱变育种与发酵工艺研究［Ｄ］．上海医药
工业研究院，２００６．
［３］张 苑 ，金志华 ，林建平 ，等．多杀菌素的高效液相色谱法测定
［Ｊ］．农药，２００３，４２（１０）：２７－２８．
［４］方积乾．医药数理统计方法［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９９５．
［５］熊宗贵．发酵工艺原理［Ｍ］．中国医药科技出版社，１９９５．
及发酵工艺研究工作。
1. 2. 1 培养条件
将 Ａｉｎｏ ０１～０５ 接入斜面培养基，２８ ℃培养
８ ｄ，刮下孢子接入种子培养基，２８ ℃培养 ７２ ｈ
（２５０ ｒ／ｍｉｎ）， 以 １５％接种量接入发酵培养基，２８ ℃
培养 １９２ ｈ（２５０ ｒ／ｍｉｎ）［２］。
1. 2. 2 效价检测
取 ５ ｍＬ 发酵液，加入 ５ ｍＬ 无水甲醇，振荡 ３０ ｍｉｎ
多 杀 菌 素 （Ｓｐｉｎｏｓａｄ） 是 刺 糖 多 胞 菌 （Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ） 产生的的一种大环 内酯类抗生素。其主要成 分 包 括 ｓｐｉｎｏｓｙｎ Ａ 和 ｓｐｉｎｏｓｙｎ Ｄ，由于其独特的作用机理［１］，多杀菌素具 有高效广谱的杀虫活性；同时多杀菌素又具备生物农 药低毒、低残留的特点，是一种安全性高、与目前常用 杀虫剂无交互作用的生物杀虫剂。同时由于多杀菌素 目前在国内还处于开发阶段，尚未广泛使用，较目前 大规模应用的其他抗虫类生物农药（如阿维菌素），其 耐药性很低，因此，众多研究者都将多杀菌素作为新 一代生物农药加以研究。本实验在对多种多杀菌素发 酵用原材料（主要是碳源和氮源）进行筛选的基础上， 采用两轮次正交实验对多杀菌素的发酵培养基进行 了优化，优化后配方的发酵结果较原配方的发酵结果 有一定幅度的提高。
第 ３３ 卷第 ７ 期 ２０１０ 年 ７ 月
Ｖｏｌ．３３ Ｎｏ．７ Ｊｕｌ ． ２０１０
多杀菌素培养基配方的优化
李春田，王文举，王玉宝
（华北制药集团爱诺有限公司，河北 石家庄 ０５２１６５）
[ 摘 要] 采用正交实验法优化多杀菌素发酵培养基，得到优化配方：葡萄糖 ３２ ｇ／Ｌ、糊精 ６０ ｇ／Ｌ、酵母粉 ２５ ｇ／Ｌ、玉米浆
因素水平
实验号
相对效价 ／％
Ａ
Ｂ
Ｃ
Ｄ
１
２０
３０ ２０
５
９０．４
２
２０
６０ ３０
１０
１０５．０
３
２０
９０ ４０
１５
９５．９
４
Biblioteka Baidu
４０
３０ ３０
１５
１０９．４
５
４０
６０ ４０
５
１０１．７
６
４０
９０ ２０
１０
１０５．５
７
６０
３０ ４０
１０
８９．３
８
６０
６０ ２０
１５
９５．３
９
６０
９０ ３０
５
９８．６
Ｙ１
９７．１ ９６．４ ９７．１ ９６．９
因此，根据第一次正交实验的结果安排了第二次正交
实验，考虑到玉米浆 １０ ｇ／Ｌ 与 １５ ｇ／Ｌ 两水平相差不
多，故第二次实验只考察葡萄糖、糊精、酵母粉，玉米浆
浓度定为 １５ ｇ／Ｌ。第二次实验因素及水平安排见表 ３。
表3 水平
Ｌ９（３）３ 实验因素及水平
实验因素
Ａ
Ｂ
Ｃ
１
３２
４５
２５
２
４０
６０
３０
３
１５ ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３ ２．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．１ ｇ／Ｌ，摇瓶效价较优化前提高了 １７．１％。
[ 关键词] 多杀菌素；正交实验；发酵培养基
[ 中图分类号] ＴＱ ４６５．５
[ 文献标识码] Ａ
[ 文章编号] １００３－５０９５（２０１０）０７－００２４－０２
原配方
１００
优化配方效价较原配方效价提高了 １７．１％。
3讨论
３．１ 由上述实验得出的多杀菌素发酵培养基优化配
方为葡萄糖３２ ｇ／Ｌ、糊精 ６０ ｇ／Ｌ、酵母粉 ２５ ｇ／Ｌ、玉米浆
１５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ３ ２．０ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ ０．１ ｇ／Ｌ。 ３．２ 葡萄糖和酵母粉对效价产生影响较大，且均有
1 材料和方法
1. 1 材料 多杀菌素产生菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏ－
ｓａ）Ａｉｎｏ ０１～０５，本实验室保藏。 斜面培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ８，麦芽浸提物 １０，酵
母浸提物 ５，琼脂 ２０，ｐＨ ６．８，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。 种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ２０，酵母浸提物１２，玉米
序：葡萄糖＞酵母粉＞糊精＞玉米浆；同时 Ｙ 值反应
了各因素的不同水平对效价的影响程度，由表 ２ 可
见，Ａ（葡萄糖）的 Ｙ２＞Ｙ１＞Ｙ３，Ｂ（糊精）的 Ｙ２＞Ｙ３＞Ｙ１，Ｃ （酵母粉）的 Ｙ２＞Ｙ１＞Ｙ３，Ｄ（玉米浆）的 Ｙ３＞Ｙ２＞Ｙ１，因 此，各因素的较优水平分别为 Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ３。由于第一 次正交实验的水平间隔较大，有可能错过较优水平，
后，于 ３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ，取上清液进行效价
检测。检测条件：岛津 ＳＰＤ－２０ Ａ 色谱仪，Ｃ１８ 柱 （４．６ ｍｍ ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流动相：甲醇∶乙腈：水 ＝４５∶
４５∶１０，流速：１ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长：２５４ ｎｍ［３］。
2 结果和分析
2. 1 原材料筛选
为正交实验的考察因素，组成正交实验因素水平表［４］
（表 １），培养基中其他成分组成不变。
表 1 Ｌ９（３）４ 实验因素及水平
水平
实验因素
ＡＢ
ＣＤ
１
２０ ３０
２０ ５
２
４０ ６０
３０ １０
３
６０ ９０
４０ １５
按正交表设计实验并实施，结果见表 ２。
第７期
李春田等：多杀菌素培养基配方的优化
·２５·
表 2 正交实验结果与分析
４８
７５ ３５
按正交表设计实验并实施，结果见表 ４。
表 4 正交实验结果与分析
实验号
因素水平
Ａ
Ｂ
相对效价 ／％ Ｃ
１
３２
４５
２５
１１１．９
２
３２
６０
３０
１１３．０
３
３２
７５
３５
１０９．２
４
４０
４５
３０
１０７．３
５
４０
６０
３５
１０７．２
６
４０
７５
２５
１１１．２
７
４８
４５
３５
１００．５
８
４８
６０
２５
１０８．５
－
Ｙ２ １０５．５ １００．７ １０４．４ ９９．９
－
Ｙ３ ９４．４ １００．０ ９５．６ １００．２ －
Ｒ
１１．０ ４．３ ８．８
３．３
－
以上发酵结果为相对效价，即设对照组的发酵结
果为 １００％；每个实验号结果均为 ３ 次均值。
上述实验结果中，极差 Ｒ 的大小反应了各因素在
其对应水平下对效价的影响程度，各因素影响程度排
浆 ５，ＭｇＳＯ４ ０．１，ＣａＣＯ３ ２．０，ｐＨ ７．０，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。 发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ４０，玉米淀粉 ３０，酵母
粉 ２０，玉米浆 １０，ＫＨ２ＰＯ４ １．０，ＣａＣＯ３ ２．０，ＭｇＳＯ４ ０．１， ｐＨ ７．３，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ． 1. 2 方法
[ 收稿日期] ２０１０－０４－０９ [ 作者简介] 李春田（１９７５－），男，工程师，主要从事菌种改良
通过生长谱实验进行原材料筛选，以确定适宜多
杀菌素生长的原材料。总计筛选如下原材料：葡萄糖、
玉米淀粉、糊精、热榨黄豆饼粉、酵母粉、花生饼粉、棉
籽蛋白、生物氮素、玉米浆、蛋白胨。确定适宜的原材
料：葡萄糖、糊精、酵母粉、玉米浆。
2. 2 正交实验设计及结果
将葡萄糖（Ａ）、糊精（Ｂ）、酵母粉（Ｃ）、玉米浆（Ｄ）作