免疫荧光 样品制备及体会

免疫荧光细胞样品制备及体会●免疫荧光细胞化学技术：将抗体标记上荧光素（如FITC、TRITC），与细胞内相应抗原（目标蛋白）结合后，通过观察、检测具有特征性的荧光，可以定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白的方法称为免疫荧光细胞化学技术。

●结合了免疫反应的特异性和荧光检测的灵敏性。

●常用方法：直接法、间接法和双标记法。

●使用免疫荧光染色，我们可以方便的观察目的蛋白在细胞中何时表达，对目的蛋白进行定性（有无表达）、定位（胞浆、胞核或胞膜）分析，以及比较其表达量的多少。

●不同的抗体通过标记不同的荧光染料，我们可以同时观察细胞中两种或多种蛋白的表达和分布。蛋白质的不同定位提示其可能具有的功能：

●胞浆：参与细胞内信号转导，蛋白质转运

●胞核：可能是转录因子参与DNA转录，基因表达调节因子

●胞膜：离子泵，参与构成离子通道、细胞间通讯，细胞内外物质交换，作为细胞因子受体

荧光染料

●具有吸收一定频率光能，并产生一定光量子的荧光团，在一定波长的激发光作用下可发射不同颜色的荧光。

●尽量了解所使用的荧光染料的特性：如激发光谱和发射光谱。比较常用的荧光染料：

FITC蓝光绿光TRITC绿光红光

Cy3、Cy5绿光红光PI绿光红光DAPI紫外蓝光Hoechst紫外蓝光

直接法

●直接用荧光标记的抗体

与细胞中的相应抗原结

合。本法简便快速，非

特异性荧光干扰少；缺

点是一种标记抗体只能

测定一种抗原，需要的

抗体量较大，昂贵且敏

感性较低。

●未标记抗体（一抗）先与细胞

中的相应抗原结合，再用荧光

素标记的抗体（二抗）与一抗

结合。本法仅需标记一种抗体

（二抗如羊）就可以检测很多

由同一种动物（如兔）制备的

不同蛋白的抗体；缺点是染色

时间较长，出现非特异性染色

的机会较多。但较直接法更敏

感，有信号放大作用。

间接法

●双标记法：在同一个细胞标本上

同时检测两种抗原，进行双重免

疫荧光染色。将两种荧光抗体

（如抗A和抗B）以适当比例混合，

加在标本上孵育。抗A抗体用FITC

标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用

TRITC标记，发红色荧光，这样就

可以明确显示两种抗原在细胞中

的定位。

双标记法

●复染细胞核的作用：判

断是否是细胞，判断细

胞状态好坏

●采集的图像看起来非常

漂亮

影响免疫荧光染色结果的因素：

1.荧光染料的浓度：

●增加荧光染料的浓度，荧光强度也会随之增加。

●增加到一定程度时，荧光强度可达到最大。

●如果再增加浓度，荧光强度反而下降。这是由于浓度过大，荧光染料分子间相互作用形成缔合分子，其本身具有荧光淬灭剂的作用。2.溶液的pH值：

每种荧光染料有其最适pH值，改变pH值会影响荧光染料的吸收，造成结合不牢固导致荧光染料淬灭速度加快，采集的图像效果模糊。整个染色过程所使用的所有液体的pH值，包括PBS、抗体稀释液等。

3.溶剂：

同一种荧光染料在不同溶剂中，其光谱波峰的位置和强度都可能会显著改变。

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拿到荧光标记抗体后，不要急着做实验，首先要认真阅读其使用说明书，注意公司推荐的染色方法，孵育温度，最适pH 值，抗体稀释液，稀释倍数，保存条件，保质期等要求。

免疫荧光染色可以获得的信息：某蛋白在细胞中表达和定位的变化，对其功能具有提示作用

●

比较具有不同生物学行为（如增殖、迁移、侵袭）的细胞中目的蛋白表达和定位是否有差异。

●

正常细胞中抗原A 原来定位于胞浆，但经刺激后转位入核，提示其可能参与基因转录过程。

●

正常情况下，抗原定A 位于胞浆，抗原B 定位于胞膜，当B 表达上调后，A 向胞膜聚集，提示蛋白B 和A 可能存在着相互作用。

细胞免疫荧光染色全过程：

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制作细胞爬片：

1.

通常使用24孔板（可以将细胞直接接种在24孔板里；或在孔板里放置玻璃盖玻片，将细胞接种在盖玻片上；前者染色后可以拿到倒置荧光显微镜下观察，后者染色后需要将盖玻片取出，用50%甘油将细胞面封在盖玻

片与载玻片之间，然后置于正置荧光显微镜下观察），可以节省抗体。

2.24孔板孔底面并不是水平的，将细胞悬液放入孔里后，

细胞容易聚集在周边贴壁，中央处细胞较少，造成细

胞分布不均。将细胞悬液放入孔里后，用吸管在孔里

反复吹打几次，使细胞充分悬浮，然后培养贴壁。染

色时，每个孔里的液体量至少为150μl，才能保证在染色过程中每个细胞能够充分接触到液体，而且不会干

片。●良好的细胞状态是获得准确荧光定位和定量结果的前提。细胞贴壁良好，胞浆充分伸展，在倒置相差显微镜下观察其胞浆胞核结构清晰，可见核仁。在染色前应用PBS充分漂洗，去除死细胞的干扰。

●细胞状态不好，正经历凋亡或死亡，很容易出现细胞变形，皱缩（A），与正常细胞相比差异很大，而且细胞核染色后可以发现细胞核也变形，不规则，染色质分布不均，有局部浓聚现象（B）。●最重要的影响是整个细胞会

发生非特异性着色，发出均匀一致的荧光，没有明确定位，结果不具有特异性。这与正常的胞浆胞核或胞浆胞膜同时着色也不一样，正常情况下若同时着色也是一定以某个部位为主（A、B）。

●细胞密度：根据实验目的调整细胞接种密度

1.对细胞个体进行形态学观察以及定位荧光信号：细胞密度稍稀疏。使细胞充分伸展，显示出其应有的形态和结构；但也要注意保证视野内有一定数目的细胞，以便选取有代表性的细胞采图；而且如果细胞数过少，上机测定时，寻找细胞花费时间太多，激发光长时间照射也容易引起荧光淬灭。这时要求细胞所占面积不低于视野的20%。

2.定量测定荧光强度（观察某种蛋白的表达量）：

细胞密度应稍高。用于做大量细胞的统计定量，细胞至少要占到视野面积的80%；这时细胞要

布满视野但相互之间还有空隙，细胞排列均匀，不聚堆拥挤，防止细胞间挤压变形，影响定量

结果。达到通常所说的亚融合状态（sub-

confluent）。