NG2与少突状胶质细胞

6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应， 炎症较少
• 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 • 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况
ConA:+ positive ①植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 ②单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入 anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE
雌鼠 步骤：① MOG35-55(200ug)+PBS水溶液100ul 皮下两侧 ② H37RA(结核分枝杆菌300ug)+ 尾静脉 然后300ul不完全弗氏佐剂超 声乳化 ③尾静脉一次每只0.1ml+百日咳病毒（原液400ng/ul) 用PBS稀释使用,每只老鼠腹腔注射0.1ml，第2天注射。
利用同源重组技术
2.表明NG2与CNS损伤的炎症息息相关
胶质瘢痕 : ①由于缺氧、低血糖、感染、中毒等均能引起脑组织的损伤而 导致星形胶质细胞增生。反应性星形胶质细胞增生是脑组织 损伤的修补反应 ②减弱星形胶质细胞增生，有利于改善脑缺血后神经功能恢复 胶质瘢痕形成是一个极其 复杂的病理生理过程，包括组 织水肿、炎症反应、局 部缺血、谷氨酸受体高反应性、脂质 过氧化作用、钙离子超负荷、自由基损伤、反应性星形胶质 细胞增生
小胶质细胞&巨噬细胞
激活的星形胶质细胞
Stress marker-positive cells
浸润的T细胞
大脑皮层
脊髓
2.NG2KO mice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微
EAE相关的促炎性基因的mRNA的表达情况
3.EAE induced NG2KO mice，OPCs的数量无改变
• EAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中， 显著减少（脱髓鞘过程中） Whether NG2 缺失影响少突状胶质细胞的免疫反应？ 首先要证明NG2是不存在的或不生成 免疫荧光定量分析OPCs数量 确定PDGFRα 确定NG2的确敲除了， 且在NG2KOmice中不表达
• 骨髓嵌合体小鼠 =淋巴造血系统嵌合体 = 放射性嵌合体 • ①彻底破坏受者机体骨髓的造血系统，最大程度的杀灭肿 瘤细胞 • ②骨髓含造血干细胞，血液也有 • ③白血病 • ④同基因型
5.FITC-dextran
• 血管内皮通透性试验
• 脑微血管内皮细胞（BMEC）拥有丰富的酶系统，但缺乏 收缩蛋白，故正常生理状态下组胺、5-羟色胺、白三烯C4 等血管活性物质较少影响血脑屏障 • 而病理状态下因BMEC酶系统活性改变，活性物质将影响 BMEC，从而进一步影响血脑屏障的通透性。
• 开放的血脑屏障能让大分子如右旋糖酐通过
在EAE中，NG2与神经炎症、血脑屏 障改变、OPCs反应及DCs激活有关
Introduction
1.NG2-硫酸软骨素蛋白多糖，OPCs和激活的周细胞表达，NG2、
PDGFRα 是OPCs（ NG2 cell ）的marker，当其分化成少突状 胶质细胞时，这两个marker不表达 ①CNS损伤时，OPCs反应性增殖，表达NG2的细胞在炎症部位聚集 ②EAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中， 显著减少 ③OPCs分化为少突状胶质细胞，促进髓鞘的生成 ④CNS微血管中，周细胞促进血管生成，促进紧密连接的形成， 从而保护BBB通透性和维持内皮细胞屏障的功能； CNS损伤时，充当炎症传感器，免疫监视，执行中性粒细胞 巨噬细胞的功能
骨髓移植技术 NG2KO mice的免疫反应与EAE临床表现有关 炎性因子
是否NG2KO免疫系统的重构造成了接种小鼠的 BBB差异？
3.NG2
EAE BBB渗透性改变的疾病 炎症浸润 CNS损伤有关
4.NG2KO mice ，EAE的临床表现型更轻微
Unexpectedly，NG2有助于EAE的发病机制 OPCs及周细胞表达NG2 原因 免疫细胞也表达NG2
Abstract
• 在成年人的CNS中，OPCs表达NG2 • 在病理情况下，NG2是周细胞激活的marker EAE BBB渗透性改变的疾病 • NG2 炎症浸润 CNS损伤有关
1.在NG2KO mice中诱导EAE的发生 ①相比WT,NG2KO mice EAE临床评分更轻微 研究思路 ②OPCs的数量在EAE诱导后无改变 2.发现NG2在免疫细胞中表达，如T细胞、巨噬细胞 树突状细胞 3.评估了T细胞致脑炎性物质 ①WT NG2KO mice增殖的致脑炎物质MOG35-55水平相同 ②However，NG2 KO mice T 细胞反应偏向于Th2型反应 4.是否分泌了炎性因子，联想到DCs，测定IL-12表达情况 ① NG2KO mice中，IL-12-expressingCD11c+细胞显著减少 ② 更重要的是，在WT mice中，IL-12的表达在CD11c+NG2-cell比 CD11c+NG2+cell 要更少 5.是否NG2与免疫系统和CNS水平有关-----骨髓嵌合体老鼠 ①相比接受WT骨髓的mice，接受NG2KO mice骨髓的，EAE症状更轻微
T 增 值 情 况
ConA-CD3-TCR ConA-NG2-NG2
抑炎
促炎
• DCs 髓系DCs：IL-12 Th0 Th1 BMDDCs 淋巴系DCs：IL-4 Th0 Th2
7. NG2KO mice，IL-12表达减少&NG2 参与DC的激活
IL-12
WT
是否IL-12表达与NG2表达有关？
1.NG2KO mice 的EAE表现型更轻微
A representative of three independent experiments is presented
disease incidence (84 ± 4.5 vs. 100 % in WT mice) Disease onset was delayed (13.06 ± 3.66 vs. 8.16 ± 1.71 days for WT mice)
6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应， 炎症较少
• 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 • 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况
ConA:+ positive ①植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 ②单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入 anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE
在EAE中，NG2与神经炎症、血脑屏 障源自文库变、OPCs反应及DCs激活有关
影响因子：12.213 Accepted: 15 March 2016
Moransard 等人研究EAE在NG2KO mice的作用， 发现与WT mice并没有发现任何差异 而本作者采用通过样的方法，发现NG2在EAE 中发挥着重要的作用
实验方法 工具
• • • • • 1.ELISA---酶联免疫吸附试验 2.EAE 建模方法 3.工具鼠 4.bone marrow chimeramouse 5.血管内皮通透性试验
1.ELISA---酶联免疫吸附试验
OD
2.EAE 建模方法
• EAE模型是中枢神经系统内小血管周围出现单核细胞浸润 及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化 （MS）的理想动物模型。
Results
• 1.NG2KO mice 的EAE表现型更轻微 • 2.NG2KO mice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微 • 3.EAE induced NG2KO mice，OPCs的数量无改变 • 4. EAE induced NG2KO mice，紧密蛋白的连续性分布与BBB 功能有关 • 5.免疫细胞表达NG2 • 6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应，炎症较少 • 7. NG2KO mice，IL-12表达较少&NG2参与DC的激活 • 8.NG2不参与巨噬细胞的极化 • 9. NG2KO mice ,可调节的免疫反应&保守的BBB导致了EAE轻 微的表现型
4. EAE induced NG2KO mice，紧密蛋白的连续性 分布与BBB功能有关
• 周细胞： 神经血管形成 BBB功能 NG2KO mice 中，是否神经炎症水平降低与血脑屏障特异性改 变有关 研究了内皮细胞的紧密连接蛋白 、claudin-5、 occludin（咬 合蛋白）的结构和功能的分布 血脑屏障结构和功能的改变与紧密连接蛋白的表达变化有关
26/33 ×100%=78.78%
A representative of three independent experiments is presented
CD45：血管周浸润的炎性细胞，巨噬细胞 CoII IV :microvessel basal lamina TO-PRO-3：细胞核
脊髓截面染色
EAE
the insertion of a 1100-bp neomycin-resistance
在NG2KO mice中，NG2特异性的信号没有被发现（基于NG2敲除的 前提下，理解为没有生成），实验更加严谨---------IFN-γ
研究NG2缺失
EAE
免疫荧光定量分析OPCs数量
MBP:神经纤维 APP:损伤的轴突
T Cell BMDDCs BMDMs
CD3:T Cell CD11c：BMDDs CD11b:BMDMs DAPI：核酸，DNA AT区
6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应， 炎症较少
• 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 • 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况
ConA:+ positive ①植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 ②单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入 anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE
Dextran-FITC experiments –血管内皮通透性试验
NG2KO mice周细胞缺乏NG2影响TJs的动态组合 可替换信号 转导途径
5.免疫细胞表达NG2
• NG2KO mice，巨噬细胞产生更少的炎性物质，浸润能力减 弱 • NG2可能与其他炎性细胞浸润CNS有关 ， whether NG2 is expressed in WT mice or not by cells of the systemic immune system. ?
3.工具鼠
× F1 NG2+/- Mice
WT C57Bl/6J mice
F2 NG2-/- Mice
×
&
NG2+/+ Mice
WT Mice 纯合的 NG2KO mice the insertion of a 1100-bp neomycin-resistance
F1
WT
4.bone marrow chimeramouse
NG2-CD11c+ cells中，lL-12表达较少 NG2表达与DCs分泌IL-12有关，进而与 Th0 Th1有关
8.NG2不参与巨噬细胞的极化
是否NG2与巨噬细胞极化有关
IFN-γ
IL-4
M1：CD86 MHC Ι Ι M2：CD206
9. NG2KO mice , EAE轻微的表现型是 因为可调节的免疫系统&保守的BBB
6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应， 炎症较少
• 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 • 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况
ConA:+ positive ①植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 ②单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入 anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE