病毒学实验技术

病毒学实验技术

实验一鸡胚接种

器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI）

一．精卵的选择、孵育和检卵

1.受精卵的选择

1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响

2）最好是白克蛋

3）受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

2.孵育

1）孵箱温度保持37.5—38.5℃

2）相对湿度：50-60%

3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后

4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次

3.检卵

孵育后第4天开始，每天检卵一次。4日卵可见血管。未受精卵不见血管鸡胚。死胚血管模糊，无胎动。

二．鸡胚的结构

1．卵壳上有细孔，以行气体交换

2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流

3．气室呼吸和调节压力

—卵壳孔交换

4．绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管—O

2

5．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。

6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水

7．卵黄早期养分

8．卵白晚期养分

三．接种前处理

1．做接种记号

2．消毒

四．接种途径

卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体

1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖

方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下

2）碘及酒精消毒气室端

3）钢锥在气室中央锥一小孔

4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚

5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚

方法二：1）2）同一

3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒

4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚

5）封孔，续孵，弃24h内死胚

2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖

方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒

2）在气室端开一1.5×1.5口

3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜

4）滴入接种物

5）胶布或透明纸封口

方法二：（人工气室）

1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈]

2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗

3）在气室端中央钻一个小孔

4）用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出

5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗

6）用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上

7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔

8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上

3．尿囊腔接种法用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖

1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒

2）钢锥锥一小孔

3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚

4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚

静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒

实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）

器材：鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪镊子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞

一．实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途

二．实验步骤：

1.取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒

2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿

3.眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank’S洗液两次

4.剪碎近于乳糜状

5.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank’S两次，然后加入4倍量的（5ml）

5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37℃水浴20-30分钟，0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO

3

期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）

6.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank’S液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用

7.加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中

8.平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml Hank’S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。使细胞量约为50万个/ml，再补加Hank’S生长液至10ml，37℃培养

实验三传代细胞培养

（传代细胞=遗传突变/理化学物质作用/致瘤病毒作用=异倍体癌变细胞；多来自动物或人的肿瘤组织及部分来自突变的正常细胞。成长旺盛，繁殖快速，但易遭支原体和病毒污染—细胞源性/非-细胞源性如毒种、血清、胰酶、操作人员口鼻手等）

一、试剂

1．细胞分散剂：0.25%胰酶，250ML装，4℃保存胰酶 2.5g NaCl 8.0g KCL 0.2g

Na

2HPO

4

·12H

2

0 2.89g

KH

2PO

4

0.2g

加ddH20至 1000ml

加压过滤除菌，分装于小瓶备用。（细胞消化液：将胰酶2.5g、NaCl 80.0g、KCL 4.0g、

葡萄糖10.0g、NaHCO

3 5.8g依次溶于900.0ml ddH

2

O中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，

过滤除菌，分装后置-20℃保存备用）

2．培养基

DMEM培养液：1袋DMEM干粉溶于950ml ddH2O中，加入3.7g NaHCO

3

，用1mol/l HCL 调PH值至6.8-7.0，定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌，室温保存备用。

生长液：含10%犊牛血清的DMEM培养液（可室温保存）。（细胞生长液：在DMEM培养液中加入10%的新生牛血清，100IU/mL青霉素、100μg/ml链霉素，4℃保存备用）

3．双抗：母液20000u（ug）/ml，用量：500ml DMEM 加入5ml，可4℃保存。

4．血清：500ML装，用前在56℃水浴灭活30MIN，每500MLDMEM加入50ML。

5．器材：吸管（5、10ml）、细胞瓶、胶塞（含盐水瓶塞）、吸球、75%酒精棉球等。

二．操作步骤

1.先配置生长液（500ml DMEM加入50ml血清和5ml双抗，混匀）

2.取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液，可用适量生长液冲洗。

3.吸弃，加入3-4ml胰酶/10ml 细胞浸没细胞层，亦可先洗涤细胞层后弃之），于37℃培养箱放置几分钟或室温3-5min（PK-15）（7-8min，Marc-145），镜下观察至细胞间出现空隙或稍松动或稍变圆或稍拉网（PK-15）或细胞变圆（Marc-145）后，尽弃胰酶消化液（注意：时间要掌握好，勿消化过头，如拉网状或脱落）。

4.加入生长液（约6-7-9ml/10ml瓶），反复吹打几次，（先正面吹打，在反面吹打）使细胞分散成游离单个细胞（镜检，细胞呈单个，成双、3-4个团块即可），然后分装于3个小瓶中（PK-15），补足生长液至10ml（或吹散成单个细胞后，加入3个细胞瓶所需生长液30ML 再分装，10ml/瓶，要利用原瓶，其生长较好），37℃培养箱培养1-2天即可长成单层。如是分装6孔细胞板，每孔加入3-4ml，用吸管抽吸一下孔内细胞悬液使之均匀不成团生长。24孔板，1ml/孔。96孔板，一般将病毒与细胞同时接入，详见毒价测定法。细胞长好后，接毒前可用维持液洗涤并吸弃。接毒量根据病毒浓度而定，一般100-200ul/孔，吸附45-60min，然后加入维持液。37℃培养30-40h（PRV），观察CPE，出现70-80%CPE时可收获，不论如何，病毒于40h前收获，以免病毒释放到细胞外。对于污染孔，小心吸弃，加入适量双抗，首次作冲洗，二次作抗菌。对可能污染孔，加入适量双抗如10ul/24孔。

细胞板的处理：胰酶处理—自来水冲净—用镊子夹棉球擦洗掉上面的细胞残留物—浸泡酸液过夜—自来水冲洗—用双蒸水洗涤—控干—将细胞板和板盖正象平铺于干净或消毒过的报纸紫外灯下照射消毒杀菌过夜—次日将盖合上—用下面的报纸包好—近期使用。

常用传代细胞：

1．IBRS-2（仔猪肾上皮传代细胞株）；

2．Vero（非洲绿猴肾细胞）；

3．Marc-145（MA-104进一步克隆而来）；

4．BHK-21（乳仓鼠上皮传代细胞株）；

5.MDCK（犬肾上皮细胞）；

6.F81（猫肾细胞）；