第14章_核酸的物理化学性质

3）内切酶
二、核酸的酸碱性质
核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两 性电解质。 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也 含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨 基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点 为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH 通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，DNA没有这种作用。
• 3、根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和 核酸内切酶
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1）核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端 （3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；
2）核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从 多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。
4、常用核酸酶
1）核糖核酸酶 牛胰核糖核酸酶（简称RNaseⅠ，其作用点为3’－ 嘧啶核苷酸与其它核苷酸之间的连键，产物为3’－嘧 啶核苷酸或以3’－嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸）； 核糖核酸酶T1（其有比RNaseⅠ更高的专一性，它的
核酸的溶液的紫外吸收又可以用摩尔磷的吸光度 ε（ P ）表示： A ε（ P ）＝ cL
其中A为吸光值，c为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径。摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸.
研究发现， DNA 双螺旋结构可使 碱基对堆积，造成π 电子云重叠， 产生低吸收效应，如变性破坏 DNA 的碱基对，则可使紫外线吸收增加 大约25 ％，此现象称增色效应。据 此我们可判断 DNA 制剂是否发生 变化。 如 DNA 的 摩 尔 磷 紫 外 吸 收 ε （ P ）约为 6000 ， 变性后变为 10000。
四、核酸的变性、复性及杂交
• （一）DNA变性
1、概念：它是指 DNA 双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并 不涉及共价键的断裂。 如多核苷酸骨架上共价键断裂则称为核酸的降解，降解 可使核酸相对分子量降低。
1）核酸变性后形态的改变
双螺旋DNA和具双螺旋区的RNA氢键断裂，空间结构被
破坏，形成单链无规则线团状的过程。
三、核酸的紫外吸收
1、原理： 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键， 使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240 －290nm的紫外波段有一强烈的吸收 峰，最大吸收值在260nm附近。
DNA
2、应用
1）不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行 定性、定量测定。 A值为1相当于：50μg/ml DNA 40μg/ml 20μg/ml RNA Nt(寡核苷酸）
（二）酶水解
• 生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚 核苷酸链中的磷酸二酯键。 1、按作用底物分类 以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的 RNA水解酶（RNases）。 2、按磷酸二酯键断裂方式分：作用于3’－磷酸酯键（降解 核苷酸带5’－磷酸）；b、作用于5’－磷酸酯键（降解核苷 酸带3’－磷酸）。
一、核酸的水解
核酸嘌呤碱的 N9 和嘧啶碱的 N1 与戊 糖的C1形成N－糖苷键。磷酸基与2种戊 糖分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸 酯。所有这些糖苷键与磷酸酯键都能被 酸，碱和酶水解。
N-糖苷键
Hale Waihona Puke Baidu
（一）酸或碱水解
核酸中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断，但 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。 如：在0.1mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解， 生成 2 ’－或 3 ’－磷酸核苷， DNA 在同样条件则不受影响。 这种水解性能上的差别与 RNA 核糖基上 2 ’－ OH 的邻基参与 作用有很大的关系，在 RNA 水解时， 2 ’－ OH 首先进攻磷酸 基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用 下形成水解产物。 但在酸性条件下，DNA的糖苷键比 RNA的糖苷键易水解， 嘌呤碱基比嘧啶碱基易水解，如 DNA 的嘌呤碱在 pH2 以下 即可脱落而使DNA成为无嘌呤酸。
2）结果： A、增色效应：260nm紫外吸收增加；
B、粘度下降、浮力密度上升；
C、生物学性能部分或全部丧失。
3）引起变性的因素：
温度、pH、尿素（测定DNA序列时常用的变 性剂）、甲醛（测定RNA分子大小时常用的变性 剂）等。
2、核酸变性示例——热变性与Tm
1 ） Tm 定 义 ： 当 DNA 的 稀盐溶液加热到 80 ～ 100 度时，双螺旋结构解体， 形成无规则线团，研究发 现， DNA 的变性是爆发式 的，变性作用发生在一个 很窄的温度范围内，有一 个相变的过程，通常把加 热变性使 DNA 的双螺旋结 构失去一半时的温度称为 该 DNA 的熔点或熔解温度 （ melting temperature), 用 Tm 表示。 DNA 的 Tm 一般 在82－95°C之间。
作用点为3’－鸟苷酸与其相邻核苷酸的5‘－OH之间的 连键，产物为3’－鸟苷酸或以3’－鸟苷酸为结尾的寡 核苷酸）； 核糖核酸酶T2（其作用位点为Ap残基，可以将tRNA完 全降解为3’－腺苷酸结尾的寡核苷酸)。
RNaseⅠ
2）脱氧核糖核酸酶
• （ 1 ）牛胰脱氧核糖核酸酶（ DNase Ⅰ），此酶断开双 链DNA或单链DNA成为5’－磷酸为末端的寡核苷酸，平 均长度为4个核苷酸； • （2）牛脾脱氧核糖核酸酶（ DNase Ⅱ），此酶只降 解DNA成为3’－磷酸末端的寡核苷酸，平均长度为6核 苷酸; • （3）链球菌脱氧核糖核酸酶，其只作用于DNA，产物 为5’－磷酸为末端的碎片，其长度不一，需Mg2+。
2）DNA Tm值的影响因素
• （1）DNA的均一性
均 质 DNA 如 一 些 病 毒 的 DNA， 人工合成的多聚腺嘌呤－胸腺 嘧啶脱氧核苷酸熔解过程发生 在一个较小的温度范围之内， 异质 DNA 熔解的过程发生在一 个较宽的温度范围之内，所以 Tm 值可作为衡量 DNA 样品均一 性的标准。
对于不纯的核酸可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带之后， 经EB染色后在紫外灯下粗略的估计其含量。
2）确定所提取的核酸是否纯品。
1）DNA： ≈ 1.8 纯品 OD260/OD280 ＞ 1.8 RNA 污染 ＜ 1.8 protein污染 2）RNA： OD260/OD280 ≈ 2.0 纯品
3）判断DNA制剂是否发生变形或降解