酶活力计算公式
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固态发酵漆酶活性测定:
酶液制取:5g 发酵样品以1:20(W/V )比例用蒸馏水悬浮,200 r/min 摇3h ,之后5000 r/min 离心20min 。(上清用0.45µm 滤纸过滤,于-20℃保存滤液,取能整除的滤液体积用于漆酶活性测定。)
酶活反应体系3.0mL (2.3mL 0.2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液;pH=4.5
0.5mL 粗酶液稀释液;0.2mL 1mmol/L 的ABTS ) 420nm 处测定吸光值的变化。
此实验固态发酵漆酶活性计算公式:
5g 0.5mL 100mL L T 36000V 10)g (/U 3420⨯⨯⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=酶总OD V N
N :酶液稀释倍数
V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积(mL )
V 酶: 反应添加的酶液体积(mL )
△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值
36000: 420nm 处ABTS 氧化态的摩尔吸光系数(L/mol ·cm)
T :反应时间(min )
L 为比色皿的直径(cm )。
100mL/(0.5mL ×5g):固态变成液态的稀释倍数
液态发酵漆酶活性测定:
酶活反应体系3.0mL (2.3mL 0.2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液;pH=4.5 0.5mL 粗酶液稀释液;0.2mL 1mmol/L 的ABTS )
L T 36000V 10)g (/U 酶3420总⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=
OD V N
N :酶液稀释倍数 V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积(mL )
V 酶: 反应添加的酶液体积(mL )
△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值
36000: 420nm 处ABTS 氧化态的摩尔吸光系数(L/mol ·cm)
T :反应时间(min )
L 为比色皿的直径(cm )。
固态发酵锰过氧化物酶(MnP )活性测定:
酶液制取:粗酶液制备发酵过程中每隔 2 d 取 5 g 发酵物于 250 mL 三角瓶中,加入 100 mL H 2O ,在 200 r / min 的摇床中振荡提取 3 h ,之后5000 r/min 离心20min 。(用滤纸过滤后,取滤液用于测定MnP 酶活性。)
在 4 mL 反应体系中含 50 mmol/L( pH 4 ~5) 的乳酸钠缓冲液 3. 4 mL ,1. 6 mmol/L 的硫酸锰溶液0. 1 mL ,酶液 0. 4 mL ,预热至 37 ℃ 时,加 1. 6 mmol / L 的 H 2O 2溶液 0. 1 mL 启动反应。在 238 nm 紫外光处,测定反应 4 min 内OD 238差值。在对照组中,以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液,以蒸馏水代替H 2O 2溶液,其他反应物不变。每分钟使1 μmol/L 的 Mn 2 +转化为 Mn 3 +所需的酶量为 1 个酶活力单位( U) 。(ε238 = 6.5mM -1.cm -1)
此实验固态发酵MnP 活性计算公式:
5g 0.4mL 100mL L T 6500V 10)(/U 3238⨯⨯⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=酶总OD V N mL
N :酶液稀释倍数
V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积(mL )
V 酶: 反应添加的酶液体积(mL )
△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值
6500: 238nm 处Mn 2 +转化为 Mn 3 +摩尔吸光系数(L/mol ·cm)
T :反应时间(min )
L :比色皿的直径(cm )
100mL/(0.4mL ×5g):固态变成液态的稀释倍数
液态发酵锰过氧化物酶(MnP )活性测定:
锰过氧化物酶(MnP )活性测定
在 4 mL 反应体系中含 50 mmol/L( pH 4 ~5) 的乳酸钠缓冲液 3. 4 mL ,1. 6 mmol/L 的硫酸锰溶液0. 1 mL ,酶液 0. 4 mL ,预热至 37 ℃ 时,加 1. 6 mmol / L 的 H 2O 2溶液 0. 1 mL 启动反应。在 238 nm 紫外光处,测定反应 4 min 内OD 238差值。在对照组中,以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液,以蒸馏水代替H 2O 2溶液,其他反应物不变。每分钟使1 μmol/L 的 Mn 2 +转化为 Mn 3 +所需的酶量为 1 个酶活力单位( U) 。(ε238 = 6.5m M -1.cm -1)
此实验固态发酵MnP 活性计算公式:
L T 6500V 10)(/U 酶3238总⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=
OD V N mL
N :酶液稀释倍数 V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积(mL )
V 酶: 反应添加的酶液体积(mL )
△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值
6500: 238nm 处Mn 2 +转化为 Mn 3 +摩尔吸光系数(L/mol ·cm)
T :反应时间(min )
L :比色皿的直径(cm )
固态发酵木质素过氧化物酶(LiP )活性测定:
酶液制取:5g 发酵样品以1:20(W/V )比例用蒸馏水悬浮,200 r/min 摇3h ,之后5000 r/min 离心20min 。(上清用0.45µm 滤纸过滤,于-20℃保存滤液,取能整除的滤液体积用于木质素过氧化物酶活性测定。)
测酶活:3mL 反应混合液包括3.4mL 酒石酸钠(250mM , pH 3.0),0.1mL 10mM 藜芦醇,0.4mL 酶样品。在30±1℃下温浴5min 后,于反应加入0.1mL 10mM H 2O 2启动酶促反应,以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液,以蒸馏水代替H 2O 2溶液作对照,测OD310(ε310= 9.3×103M −1cm −1)处反应5min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位(U )的定义:每min 氧化藜芦醇生成1μM 藜芦醛消耗的酶量。
此实验固态发酵LiP 活性计算公式:
5g
0.4mL 100mL L T 9300V 10)(/U 酶3310总⨯⨯⨯⨯⨯⨯∆⨯⨯=OD V N mL N :酶液稀释倍数
V 总: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积(mL )
V 酶: 反应添加的酶液体积(mL )
△OD 420: t 时间内反应液在420nm 处吸光度的增加值
9300: 310nm 处摩尔吸光系数(L/mol ·cm)
T :反应时间(min )
L :比色皿的直径(cm )
100mL/(0.4mL ×5g):固态变成液态的稀释倍数