(自学)体外转录和翻译

体外表达可以避免过量表达对细胞的毒性，或 者形成不溶的包含体，以及表达产物在细胞内 的降解，因而可以表达一些对细胞具有毒性的 或者不稳定、容易被降解的蛋白。减少了蛋白 变性复性的困扰。
体外表达还可以在体系内添加特殊的修饰氨基 酸或者标记氨基酸，非常灵活，因而在蛋白质 折叠和蛋白质功能研究上都有重要应用。
In vitro Transcription
EcoRI
T7
Antisense: Cut with EcoRI Use T-3 polymerase
BamHI
T3
Sense: Cut with BamHI Use T-7 polymerase
Vector Maps
In vitro Transcription
-2 ul (400 ng) linearized plasmid DNA -20 U ribonuclease inhibitor -2 ul 100 mM DTT -4 ul 5 x T3/T7 RNA polymerase buffer -4 ul 2.5 mM NTPs -Sterile, DEPC treated H2O to a final volume of 19.5 ul 25 U (0.5 ul) T3/T7 RNA polymerase The reaction mixture is incubated at 37°C for 60 minutes.
DNA template is removed by the addition of 25U RNase-free DNase I and a further incubation for 30 minutes at 37°C. The reaction mixture is phenol/chloroform extracted twice, ethanol precipitated, vacuum dried and resuspended in 25ul sterile, DEPC-treated TE, pH7.5.
Plasmid with T3, T7 or SP6 promoters Linearization of plasmid DNA by restriction
enzyme In vitro transcription: Plasmid
buffer NTP labeled UTP RNA polymerase DNAse digestion, Phenol/Chloroform extraction and RNA precipitataion
也适合那些在体内表达由于宿主编码的抑制酶 作用而表达水平低的蛋白质,使其能高表达.
还可用于转录和翻译调控的研究 可合成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示
踪物质以及在蛋白质中掺入非天然的氨基酸用 于研究蛋白质的结构功能
S30体外翻译系统 (Promega)
灵活,能使用含有T7启动子和一个核糖体结合位 点的任何克隆进行翻译
Rabbit reticulocyte(兔网织红细胞系统)
兔网织红细胞用活大白兔制备,通过纯化除去兔 网织红细胞以外的污染细胞.
真核体外表达体系并非只适用于真核基因， 原核也并非只限于原核表达
——在灵活的体外表达系统中，只要序列满 足启动子和核糖体结合位点的需求，任何系 统均可匹配任何基因。
All are prepared as crude extracts containing all the macromolecular components: -70S or 80S ribosomes -tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases -initiation, elongation and termination factors, etc.
蛋白质功能研究思路
DNA水平缺失基因，上调下调基因的表达 水平对生命过程的影响
分离纯化蛋白质,研究其基本特性，直接在 蛋白质水平进行研究
蛋白样品的获得
收集大量的生物材料纯化(材料来源受限) 重组表达的方式(费时费力) 体外表达
(In vitro translation，快速，高通量快速筛选)
弹性大,加入优化成份一提高产率和溶解性(例如：修 饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正 确的二硫键，然后正确的折叠。)
E.coli T7 S30
S30原核体外翻译系统的E.coli T7 S30提取物 是由OmpT内切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的 E.coli B菌株制备,因此可增加稳定性,尤其适 用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质.
Higher specific activity compared to oligonucleotides
In Vitro Transcribed siRNAs
In Vitro Transcribed siRNAs - Equally effective as chemically synthesized siRNAs -Design effective siRNA
In vitro translation
利用体外表达，除了利用载体克隆，更快速的选 择是——在PCR时两端加上不同的启动子序列 就可以得到体外表达的模板材料了。
不利用细胞表达，体外表达不需要花时间转化转 染细胞、也不需要筛选重组克隆，也不需要培养 细胞，加入特定的细胞裂解物，利用其中的核糖 体、合成酶、tRNA、翻译起始、延伸、终止因 子、氨基酸等等蛋白质合成的必需元件，在适合 的温度下只需几个小时就可以得到蛋白质产物， 大大节约了时间和精力，在快速鉴别基因产物上 就格外有优势。
In vitro transcription reaction
Gloves should be worn at all times during preparation of in vitro RNA. All solutions should be RNase-free i.e. made with DEPC water if home-made or bought specifically to use for RNA work.
In vitro transcription reaction
Linearize the plasmid at, or near, the terminus of the insert cDNA with a suitable restriction endonuclease.
Extract plasmid DNA with an equal volume of phenol/chloroform and an equal volume of chloroform prior to ethanol precipitation.
Advantages -Price -Shorter turn-around time
Disadvantages -More hands-on -Scalability
In vitro translation
测序技术, PCR, RT-PCR技 术, 芯片技术, RNA干扰技术
核酸信息
蛋白质功能
RNA can be analysed be electrophoresis using denaturing conditions in an agarose/formaldehyde gel system.
In Vitro Transcription
探针------原位杂交 siRNA------RNAi Transcript------体外翻译，蛋白表达
S30的应用
合成放射性同位素标记的蛋白质
在E.coli体内表达蛋白质之前核实克隆的基因
用蛋白质进行转录和翻译调控的研究 用蛋白质作为蛋白纯化的示踪物 在蛋白质中掺入非天然氨基酸作结构研究
Roche RTS E.Coli
偶联反应:连续交换无细胞(CECF)系统反应
高产率(HY)生化体系
Roche RTS E.Coli
Advantages of RNA probes:பைடு நூலகம்
RNA-RNA hybrids are very stable
Tissue can be digested with RNase (dsRNA is not digested) after the hybridization reducing the background
In vitro transcription and
In vitro translation
In vitro transcription
In Vitro Transcription
目的: 体外得到单一，大量的mRNA
意义: 探针------原位杂交 siRNA------RNAi Transcript------体外翻译，蛋白表达
真核 VS 原核
满足启动子和核糖体结 合位点
E. coli lysate
对大肠杆菌蛋白合成机制十分了解,成本低,不需加帽 简单高效,可偶连体外转录和翻译,不需分步优化条件 耐受性(在含有其它不同成分杂质时仍可正常工作)
-加入特殊添加剂(蛋白酶抑制剂,分子伴侣etc) -特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸获得带标记蛋白
Linearized plasmid DNA is resuspended in DEPCtreated, autoclaved TE, pH7.5 at a concentration of approximately 200ng/ul prior to use.
4) The standard reaction conditions are set up containing the following quantities:
稳定,减少所表达蛋白质被降解的机会 简便,包含和所有偶联的转录/翻译所需要的组份 低背景,系统合成的内源蛋白质水平低 缺少一种氨基酸的氨基酸混合物以备标记需要 使用方便----混合好需要的各组分和模板,37度
保温1-2小时后置冰上5分钟 PAGE电泳,western检测,或TCA沉淀纯化
In vitro transcription reaction
You will need:
-Ribonuclease inhibitor (RNasin) -T7 or T3 RNA Polymerase -2.5 mM rNTPs -5 x T7/T3 RNA Polymerase Buffer (200mM Tris.Cl pH 8.0, 125mM NaCl, 40mM MgCl2, 10mM spermidine) -100 mM DTT -RNase-free DNase I -DEPC-treated, autoclaved
Cell-Free Expression Systems:
1: E. coli lysate tolerance
2: Rabbit reticulocyte: better for large proteins
3: Wheat germ extract: better for smaller proteins cheaper than rabbit reticulocyte
To ensure efficient translation, each extract must be supplemented with: -amino acids -energy sources (ATP, GTP) -energy regenerating systems (creatine phosphate and creatine phosphokinase for eukaryotic systems, and phosphoenol pyruvate and pyruvate kinase for the E. coli lysate) -other co-factors (Mg2+, K+, etc.).