内标法测定甲氨蝶呤血药浓度及其在小剂量甲氨蝶呤应用的监测
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作者简介：李明艳，女，本科，主管药师，临床药学。 196
况，探讨两者之间的关系以有利于该药在临床的安全有 效使用。 1 甲氨蝶呤血药浓度的测定 1.1 仪器与试药
日本岛津 LC－10Avp 高效液相色谱仪，甲氨蝶呤对 照品（中国药品生物制品检定所，批号：100138- 200603）、 甲硝唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号：101191200305）；甲氨蝶呤注射液（江苏恒瑞制药有限公司，批 号：07041412），甲醇、乙腈为色谱纯,其余均为分析纯。 1.2 方法与结果 1.2.1 色谱条件 色谱柱：SHIMADZU VP- ODS 柱（250mm×
次，另于 5 天内每天处理测定 1 次，计算出低、中、高三 率。另将相应浓度 MTX 标准溶液直接进样，将按样品
个浓度的日内、日间精密度（RSD）见表 1。
处理后测得的 MTX 峰面积与之相比，计算出 MTX 的提
1.2.7 回收率试验 取空白血浆加入甲氨蝶呤标准溶液 取回收率。结果见表 1。
分别配成 60，400，1 000μg/mL 低、中、高三个浓度的血 1.2.8 稳定性试验 取空白血浆加入甲氨蝶呤标准溶液
为考察甲氨蝶呤血药浓度和不良反应发生的相关 一次给药后的 Cmax 可能成为预示甲氨蝶呤的不良反
性，2007 年 7 月～2008 年 12 月间，测定了接受小剂量甲 氨蝶呤治疗的患者的血样 30 份，所有血样都是在患者
应发生的一个有前景的参数，并且计算出可预见不良反 应发生的 Cmax 的阈值为 0.16μmol/L[4]。国内未见相关文
源自文库
中国药物警戒第 7 卷第 4 期 2010 年 4 月 Ap ril, 2010, Vol.7, No.4
4.6mm,5μm）；流动相：甲醇：pH3.5 醋酸钠缓冲液（10：90）；
柱温：25℃；流速 ：1.0mL/min；检测波长：306nm；灵敏度
1.0AUFS。
1.2.2 标准溶液的配制 精密称取甲氨蝶呤对照品适
量，置于 10mL 容量瓶中，用 1M HCL 溶液溶解并稀释
至刻度，配成 2mg/mL 的标准溶液，再稀释成 2μg/mL 的
标准贮备液，置冰箱保存，备用。 1.2.3 样品的处理 精密吸取患者血清 0.3mL，分别加 入 10μL 甲硝唑标准溶液（5Lμg/mL），50μL 的 1mol/L 盐 酸溶液 , 涡漩振荡 10 秒，加 600μL 乙腈沉淀蛋白，涡漩
实测值（μg/mL） 62.0±3.8 396.3±14.0
1 016.4±20.2
提取回收率（%） 77.8±4.0 81.0±3.6 80.1±4.6
方法回收率（%） 103.2±6.2 98.3±3.5 101.6±2.0
日内 RSD（%） 6.0 3.6 2.0
日间 RSD（%） 8.4 3.5 4.7
甲氨蝶呤（MTX）是临床常规监测药物，但目前的血 药浓度监测只用于大剂量抗肿瘤治疗中。随着对甲氨蝶 呤的免疫抑制作用、抗炎作用及对滋养层细胞的毒性作 用的深入了解，小剂量甲氨蝶呤开始广泛应用于临床多 领域，用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫疾病以及异 位妊娠等，取得了良好的疗效，但是甲氨蝶呤的不良反 应发生率较高，达到 30%～40%，而且严重的副反应如 骨髓抑制、肝损害时有发生，很难预见，本文建立了高效 液相色谱法测定甲氨蝶呤的血药浓度并对小剂量甲氨 蝶呤治疗中进行血药浓度监测，观察不良反应的发生情
浆样品，每个浓度分别配制 5 份，按“样品的处理”项下 分别配成 60，400，1 000μg/mL 低、中、高三个浓度的血
操作，测得 MTX 和内标峰面积之比带入标准曲线后计 浆样品，分别在室温、冰冻、反复冻融条件下保存后，按
加入量（μg/mL） 60 400
1 000
表 1 甲氨蝶呤血药浓度测定回收率及精密度试验结果（n=5）
197
中国药物警戒第 7 卷第 4 期 2010 年 4 月 Ap ril, 2010, Vol.7, No.4
“样品的处理”项下操作，考察 MTX 血浆样品稳定性；另 在很大的个体差异性[1]，本实验测定的血药浓度在一定
外，对 MTX 血浆样品经处理后室温放置 12h 的稳定性进 程度上反映了甲氨蝶呤在患者体内的药动学特性，另外
0
2
4
6
8
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t/min
A
2
振荡 10 秒，15 000 转离心 10 分钟，将上清液移至 10mL
1
玻璃离心管，加 2mL 氯仿，涡漩振荡 1 分钟，3 000 转离
心 10 分钟，上层取 20μL 进样。
1.2.4 专属性实验 取空白血浆，按“样品的处理”项下 的方法处理后，并与标准品及给药后的血浆样品对照， 所得的色谱图见图 1。由图可见，在上述色谱条件下，MTX
0
2
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6
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t/min
C
20μg/L 。
A.空白血清 B.内标＋MTX 标准品 C.为患者血样 1.甲氨蝶呤 2.内标
1.2.6 方法精密度 取空白血浆加入甲氨蝶呤标准溶液 分别配成 60，400，1 000μg/mL 低、中、高三个浓度的血
图 1 甲氨蝶呤血药浓度的高效液相色谱图
浆样品，按“样品的处理”项下操作，1 天内处理测定 5 算 MTX 血药浓度，将测得量与加入量之比计算方法回收
内）及处理后的血浆样品室温放置 12 h（RE 在±4.5%之 给甲氨蝶呤血药浓度和不良反应之间的相关性作一定
内）稳定性良好。
论，只能看出更高的血药浓度预示着甲氨蝶呤不良反应
2 临床应用
的发生的趋势。日本一项在小剂量甲氨蝶呤治疗类风湿
2.1 临床资料与方法
关节炎患者监测血药浓度的研究表明在每周剂量的第
中国药物警戒第 7 卷第 4 期 2010 年 4 月 Ap ril, 2010, Vol.7, No.4
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1672- 8629（2010）04- 0196- 03
内标法测定甲氨蝶呤血药浓度及其在小剂量甲氨蝶呤应用的监测
李明艳 吴洪文 （广西医科大学第四附属医院，广西 柳州 545005）
进入维持剂量后，静滴后 1.5～2h 内抽血测定血药浓 献报道。因此需要设计更为完善、合理的实验来研究小剂
度。患者随访期 6～12 个月，观察并记录发生的不良反应。 量甲氨蝶呤治疗时血药浓度和疗效及不良反应的关系。
通过查阅病例回顾性分析这 30 例患者的临床资料，其 而为了更安全和合理用药，应对小剂量甲氨蝶呤治疗进
中类风湿性关节炎（RA）24 例，系统性红斑狼疮（SLE）2 行血药浓度监测，实施个体化给药。
例，强直性脊柱炎（AS）2 例，银屑病 1 例，湿疹 1 例。男 7
（2）甲氨蝶呤血药浓度监测多用荧光偏振免疫分析
Determination of Serum Methotrexate Concentration with Internal Standard Method and Its Apply in Low- dose Methotrexate Therapy LI Ming-yan WU Hong-wen (The 4th Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Liuzhou 545005, China) Abstract: Objective To establish a internal standard method to determine the serum concentration of Methotrexate (MTX) and apply in the low -dose MTX therapy. Methods The serum MTX concentration was determined by HPLC, with metron -idazole as internal standard. The separation was carried out using Shimadzu VP -ODS C18 (250mm×4.6mm, 5μm) column with mobile phase of methanol-sodium acetate buffer(pH3.5) (10:90) at a flow rate of 1.0mL/min． The detection wavelength was 306nm and the column temperature was 25℃． And the serum concentration was examined within 1.5～2h after intravenous injection of the patients who received low-dose MTX. Then the patients were followed-up to observe the adverse reaction. Rusults The linear range was 20～1 000μg/L(r=0.9992, n=8)． The intra-day and inter-day precision were both less than 15%. The serum MTX concentration in patients with adverse reactions were significantly higher than those without them. Conclusion The method is sensitive, rapid and accurate. We demonstrated that serum MTX concentration is worthy of detection in low-dose MTX therapy. Key words: methotrexate; serum concentration; adverse reaction
行了考察。结果表明，MTX 血浆样品在 - 20℃保存 15d 还有许多因素，如肾功能、联合用药等都有可能影响甲
（RE 在±6.1%之内）、室温 20℃放置 12h（RE 在±8.7% 氨蝶呤血药浓度[2，3]。由于实验数据单一，样本量小，临床
之内）、经 3 个冷冻 - 融解循环处理后（RE 在±3.8%之 资料为回顾性分析，因此本实验存在一定的局限性，很难
摘要：目的 建立内标法测定甲氨蝶呤血药浓度并应用于小剂量甲氨蝶呤治疗的监测中，以考察血药浓度和不良反 应发生的相关性。方法 通过高效液相色谱法，用甲硝唑作内标测定甲氨蝶呤血药浓度。色谱柱为 SHIMADZU VPODS C18（250mm×4.6mm, 5μm），流动相为甲醇 - pH3.5 醋酸钠缓冲液（10：90），流速为 1.0 mL/min，检测波长为 306nm，室温为 25℃。小剂量甲氨蝶呤治疗的患者在开始静脉滴注后 1.5～2h 内抽血测定血药浓度并随访跟踪患者 不良反应的发生情况。结果 线性范围是 20～1 000μg/L（r=0.9992，n=8），日内日间精密度均小于 15%。小剂量甲氨蝶 呤治疗中，发生不良反应组的甲氨蝶呤血药浓度显著高于没有发生不良反应组。结论 本方法灵敏、快速, 准确, 在小 剂量甲氨蝶呤治疗中应监测其血药浓度，实施个体化给药。 关键词：甲氨蝶呤；血药浓度；不良反应
1
行两份，记录峰面积。以甲氨蝶呤浓度为 X 轴，甲氨蝶呤
与内标峰面积比为 Y 轴，绘制标准曲线，在 20～1 000μg/L 浓 度 范 围 内 呈 良 好 的 线 性 关 系 ，标 准 曲 线 方 程 为 ：y ＝ 0.01033x+0.03969（r＝0.9992，n＝8）。定量限（S/N=10）为
0
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t/min
B
的保留时间为 7.82min，甲硝唑的保留时间为 5.85min，
各峰分离完全，没有干扰。
1.2.5 标准曲线与线性范围 精密吸取储备液用空白血清
2
稀释成浓度分别为 20、60、100、200、400、600、800、1 000μg/L
的系列血清样品，按“样品的处理”项下操作。每个浓度平
况，探讨两者之间的关系以有利于该药在临床的安全有 效使用。 1 甲氨蝶呤血药浓度的测定 1.1 仪器与试药
日本岛津 LC－10Avp 高效液相色谱仪，甲氨蝶呤对 照品（中国药品生物制品检定所，批号：100138- 200603）、 甲硝唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号：101191200305）；甲氨蝶呤注射液（江苏恒瑞制药有限公司，批 号：07041412），甲醇、乙腈为色谱纯,其余均为分析纯。 1.2 方法与结果 1.2.1 色谱条件 色谱柱：SHIMADZU VP- ODS 柱（250mm×
次，另于 5 天内每天处理测定 1 次，计算出低、中、高三 率。另将相应浓度 MTX 标准溶液直接进样，将按样品
个浓度的日内、日间精密度（RSD）见表 1。
处理后测得的 MTX 峰面积与之相比，计算出 MTX 的提
1.2.7 回收率试验 取空白血浆加入甲氨蝶呤标准溶液 取回收率。结果见表 1。
分别配成 60，400，1 000μg/mL 低、中、高三个浓度的血 1.2.8 稳定性试验 取空白血浆加入甲氨蝶呤标准溶液
为考察甲氨蝶呤血药浓度和不良反应发生的相关 一次给药后的 Cmax 可能成为预示甲氨蝶呤的不良反
性，2007 年 7 月～2008 年 12 月间，测定了接受小剂量甲 氨蝶呤治疗的患者的血样 30 份，所有血样都是在患者
应发生的一个有前景的参数，并且计算出可预见不良反 应发生的 Cmax 的阈值为 0.16μmol/L[4]。国内未见相关文
源自文库
中国药物警戒第 7 卷第 4 期 2010 年 4 月 Ap ril, 2010, Vol.7, No.4
4.6mm,5μm）；流动相：甲醇：pH3.5 醋酸钠缓冲液（10：90）；
柱温：25℃；流速 ：1.0mL/min；检测波长：306nm；灵敏度
1.0AUFS。
1.2.2 标准溶液的配制 精密称取甲氨蝶呤对照品适
量，置于 10mL 容量瓶中，用 1M HCL 溶液溶解并稀释
至刻度，配成 2mg/mL 的标准溶液，再稀释成 2μg/mL 的
标准贮备液，置冰箱保存，备用。 1.2.3 样品的处理 精密吸取患者血清 0.3mL，分别加 入 10μL 甲硝唑标准溶液（5Lμg/mL），50μL 的 1mol/L 盐 酸溶液 , 涡漩振荡 10 秒，加 600μL 乙腈沉淀蛋白，涡漩
实测值（μg/mL） 62.0±3.8 396.3±14.0
1 016.4±20.2
提取回收率（%） 77.8±4.0 81.0±3.6 80.1±4.6
方法回收率（%） 103.2±6.2 98.3±3.5 101.6±2.0
日内 RSD（%） 6.0 3.6 2.0
日间 RSD（%） 8.4 3.5 4.7
甲氨蝶呤（MTX）是临床常规监测药物，但目前的血 药浓度监测只用于大剂量抗肿瘤治疗中。随着对甲氨蝶 呤的免疫抑制作用、抗炎作用及对滋养层细胞的毒性作 用的深入了解，小剂量甲氨蝶呤开始广泛应用于临床多 领域，用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫疾病以及异 位妊娠等，取得了良好的疗效，但是甲氨蝶呤的不良反 应发生率较高，达到 30%～40%，而且严重的副反应如 骨髓抑制、肝损害时有发生，很难预见，本文建立了高效 液相色谱法测定甲氨蝶呤的血药浓度并对小剂量甲氨 蝶呤治疗中进行血药浓度监测，观察不良反应的发生情
浆样品，每个浓度分别配制 5 份，按“样品的处理”项下 分别配成 60，400，1 000μg/mL 低、中、高三个浓度的血
操作，测得 MTX 和内标峰面积之比带入标准曲线后计 浆样品，分别在室温、冰冻、反复冻融条件下保存后，按
加入量（μg/mL） 60 400
1 000
表 1 甲氨蝶呤血药浓度测定回收率及精密度试验结果（n=5）
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中国药物警戒第 7 卷第 4 期 2010 年 4 月 Ap ril, 2010, Vol.7, No.4
“样品的处理”项下操作，考察 MTX 血浆样品稳定性；另 在很大的个体差异性[1]，本实验测定的血药浓度在一定
外，对 MTX 血浆样品经处理后室温放置 12h 的稳定性进 程度上反映了甲氨蝶呤在患者体内的药动学特性，另外
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振荡 10 秒，15 000 转离心 10 分钟，将上清液移至 10mL
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玻璃离心管，加 2mL 氯仿，涡漩振荡 1 分钟，3 000 转离
心 10 分钟，上层取 20μL 进样。
1.2.4 专属性实验 取空白血浆，按“样品的处理”项下 的方法处理后，并与标准品及给药后的血浆样品对照， 所得的色谱图见图 1。由图可见，在上述色谱条件下，MTX
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20μg/L 。
A.空白血清 B.内标＋MTX 标准品 C.为患者血样 1.甲氨蝶呤 2.内标
1.2.6 方法精密度 取空白血浆加入甲氨蝶呤标准溶液 分别配成 60，400，1 000μg/mL 低、中、高三个浓度的血
图 1 甲氨蝶呤血药浓度的高效液相色谱图
浆样品，按“样品的处理”项下操作，1 天内处理测定 5 算 MTX 血药浓度，将测得量与加入量之比计算方法回收
内）及处理后的血浆样品室温放置 12 h（RE 在±4.5%之 给甲氨蝶呤血药浓度和不良反应之间的相关性作一定
内）稳定性良好。
论，只能看出更高的血药浓度预示着甲氨蝶呤不良反应
2 临床应用
的发生的趋势。日本一项在小剂量甲氨蝶呤治疗类风湿
2.1 临床资料与方法
关节炎患者监测血药浓度的研究表明在每周剂量的第
中国药物警戒第 7 卷第 4 期 2010 年 4 月 Ap ril, 2010, Vol.7, No.4
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1672- 8629（2010）04- 0196- 03
内标法测定甲氨蝶呤血药浓度及其在小剂量甲氨蝶呤应用的监测
李明艳 吴洪文 （广西医科大学第四附属医院，广西 柳州 545005）
进入维持剂量后，静滴后 1.5～2h 内抽血测定血药浓 献报道。因此需要设计更为完善、合理的实验来研究小剂
度。患者随访期 6～12 个月，观察并记录发生的不良反应。 量甲氨蝶呤治疗时血药浓度和疗效及不良反应的关系。
通过查阅病例回顾性分析这 30 例患者的临床资料，其 而为了更安全和合理用药，应对小剂量甲氨蝶呤治疗进
中类风湿性关节炎（RA）24 例，系统性红斑狼疮（SLE）2 行血药浓度监测，实施个体化给药。
例，强直性脊柱炎（AS）2 例，银屑病 1 例，湿疹 1 例。男 7
（2）甲氨蝶呤血药浓度监测多用荧光偏振免疫分析
Determination of Serum Methotrexate Concentration with Internal Standard Method and Its Apply in Low- dose Methotrexate Therapy LI Ming-yan WU Hong-wen (The 4th Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Liuzhou 545005, China) Abstract: Objective To establish a internal standard method to determine the serum concentration of Methotrexate (MTX) and apply in the low -dose MTX therapy. Methods The serum MTX concentration was determined by HPLC, with metron -idazole as internal standard. The separation was carried out using Shimadzu VP -ODS C18 (250mm×4.6mm, 5μm) column with mobile phase of methanol-sodium acetate buffer(pH3.5) (10:90) at a flow rate of 1.0mL/min． The detection wavelength was 306nm and the column temperature was 25℃． And the serum concentration was examined within 1.5～2h after intravenous injection of the patients who received low-dose MTX. Then the patients were followed-up to observe the adverse reaction. Rusults The linear range was 20～1 000μg/L(r=0.9992, n=8)． The intra-day and inter-day precision were both less than 15%. The serum MTX concentration in patients with adverse reactions were significantly higher than those without them. Conclusion The method is sensitive, rapid and accurate. We demonstrated that serum MTX concentration is worthy of detection in low-dose MTX therapy. Key words: methotrexate; serum concentration; adverse reaction
行了考察。结果表明，MTX 血浆样品在 - 20℃保存 15d 还有许多因素，如肾功能、联合用药等都有可能影响甲
（RE 在±6.1%之内）、室温 20℃放置 12h（RE 在±8.7% 氨蝶呤血药浓度[2，3]。由于实验数据单一，样本量小，临床
之内）、经 3 个冷冻 - 融解循环处理后（RE 在±3.8%之 资料为回顾性分析，因此本实验存在一定的局限性，很难
摘要：目的 建立内标法测定甲氨蝶呤血药浓度并应用于小剂量甲氨蝶呤治疗的监测中，以考察血药浓度和不良反 应发生的相关性。方法 通过高效液相色谱法，用甲硝唑作内标测定甲氨蝶呤血药浓度。色谱柱为 SHIMADZU VPODS C18（250mm×4.6mm, 5μm），流动相为甲醇 - pH3.5 醋酸钠缓冲液（10：90），流速为 1.0 mL/min，检测波长为 306nm，室温为 25℃。小剂量甲氨蝶呤治疗的患者在开始静脉滴注后 1.5～2h 内抽血测定血药浓度并随访跟踪患者 不良反应的发生情况。结果 线性范围是 20～1 000μg/L（r=0.9992，n=8），日内日间精密度均小于 15%。小剂量甲氨蝶 呤治疗中，发生不良反应组的甲氨蝶呤血药浓度显著高于没有发生不良反应组。结论 本方法灵敏、快速, 准确, 在小 剂量甲氨蝶呤治疗中应监测其血药浓度，实施个体化给药。 关键词：甲氨蝶呤；血药浓度；不良反应
1
行两份，记录峰面积。以甲氨蝶呤浓度为 X 轴，甲氨蝶呤
与内标峰面积比为 Y 轴，绘制标准曲线，在 20～1 000μg/L 浓 度 范 围 内 呈 良 好 的 线 性 关 系 ，标 准 曲 线 方 程 为 ：y ＝ 0.01033x+0.03969（r＝0.9992，n＝8）。定量限（S/N=10）为
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的保留时间为 7.82min，甲硝唑的保留时间为 5.85min，
各峰分离完全，没有干扰。
1.2.5 标准曲线与线性范围 精密吸取储备液用空白血清
2
稀释成浓度分别为 20、60、100、200、400、600、800、1 000μg/L
的系列血清样品，按“样品的处理”项下操作。每个浓度平