miR137及其靶基因Kruppel样转录因子12在多发性骨髓瘤中的表达及预后意义重点
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【Key words】 Multiple myeloma; miR137; Kruppel-like factor 12 Fund program: National Natural Science Foundation of China (General Program) (81172255)
多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞恶性肿瘤，占 所有恶性血液病的 10 %。 现阶段 MM 是无法根本治 愈的，分析其预后因素对治疗 MM 显得尤为重要［1-2］。 微 RNA（miRNA）是一类长度约 22 个碱基的非编码 小 RNA，它可以在转录后水平调控基因的表达，从而
1.2 细胞株及其培养
MM 细胞株 NCI-H929 购自美国典型培养物保存 中心（ATCC）。 用含 10 % 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养液（美国 Gibco 公司），在 37 ℃、5 % CO2、 饱和湿度下培养。 构建 miR137 过表达质粒和空白对 照质粒，包装慢病毒，分别感染 NCI-H929 细胞，分别 为表达 miR137 的 NCI-H929 miR137 OE 细胞株和空 白对照 NCI-H929 miR137 EV 细胞株：在 12 孔板中铺 1×105 个／孔 NCI-H929 细胞；取病毒贮液 100 μl，加 入含 polybrene（5～8 μg／ml）的培养液中，总 体积 0.5 ml；弃除旧的培养液，加入含病毒培养液，4 ℃置 2 h 后，37 ℃过夜；次日晨换完全培养液继续培养 48 h。 扩大培养后，流式细胞术分选。
【关键词】 多发性骨髓瘤； miR137； Kruppel 样转录因子 基金项目：国家自然科学基金面上项目（81172255）
Expression of miR137 and its target gene Kruppel-like transcription factor 12 in multiple myeloma and their prognostic value Zhang Shuaishuai, Xu Yan, Deng Shuhui, Qin Yu, Du Chenxing, Mao Xuehan, Qiu Lugui State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, China Academy Medical Science and Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China Corresponding author: Qiu Lugui, Email: drqiu99@medmail.com.cn
· 327 ·
端具有 3 个 C2H2 锌指结构，KLF 基因的表达贯穿在 整个生命活动中，在细胞增殖、凋亡、分化以及胚胎发 育中发挥着重要的作用。 KLF12 基因是 miR137 的一 个靶基因，在 KLF 家族中有举足轻重的地位，在脂类 物质代谢中重要的转录因子，在糖尿病的发生发展中 发挥重要的调节作用［4］。 本研究通过分析 KLF12 和 miR137 在 MM 中的表达情况， 并对有关的临床资料 进行分析，从而系统性判断 miR137-KLF12 与 MM 患 者预后的关系［5］。
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白血病·淋巴瘤 2016 年 6 月第 25 卷第 6 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, June 2016, Vol. 25, No. 6
·论著·
miR137及其靶基因 Kruppel 样转录因子 12 在多发性骨髓瘤中的表达及预后意义
张帅帅 徐燕 邓书会 秦宇 杜晨星 毛雪涵 邱录贵 300020 天津， 中国医学科学院 北京协和医学院 血液学研究所 血液病医院 实验血液 学国家重点实验室 通信作者：邱录贵，Email：drqiu99@medmail.com.cn
1.3 实时定量聚合酶链反应（PCR）检测各 基因表达
TRIzol 法提取分选后的 MM 患者、健康人 CD138+ 细胞或者 NCI-H929 细胞，采用 Nanotrop2000 超微量 分光光度计测定吸光度（A）260 值、A280 值。 A260／A280
比值在 1.7～2.0， 说明纯度尚可， 适合 PCR 实验。 miR137 以 U6 为内参照，二者引物由美国 Genecopoeia 公 司 合 成 ， 反 转 录 合 成 cDNA 及 PCR 参 考 美 国 Genecopoeia 公司 All-in-One miRNA qRT-PCR Reagent Kit 说明书进行。 KLF12 反转录 cDNA 的合成及 PCR 扩增参考北京全式金生物技术有限公司说明书进行， 上游引物 5'-CCTTTCCATAGCCAGAGCAG-3'，下游引 物 5'-TTGCATCCCTCAAAATCACA-3'， 以 GAPDH 为 内参照，上游引物 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'， 下 游 引 物 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。 反 转 录：总 RNA 2 μg，2.5 U／μl PolyA 聚合酶 1 μl，RTase Mix 1 μl，5XPAP／RT Buffer 5 μl，Spike-in control 1 μl，混匀，37 ℃反应 60 min，85 ℃反应 5 min。 实时 定 量 PCR：ddH2O 3.6 μl，2 ×All-in-One qPCR Mix 10 μl，Universal Adaptor PCR Primer（U6，2 μmol／L） 2 μl，miR-137 qPCR Primer （2 μmol／L）2 μl，1st strand cDNA （5 倍稀释液）2 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，混匀；应用 Gene Amp PCRsystem7500 PCR 扩增仪（美国 Ambion RNA 公司），反应条件为预变 性 95 ℃ 10 min，1 个循环；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 10 s，40 个循环。 以 2-ΔCt 为目的基因 相对表达量。
ΔCt＝Ct 目的基因 -Ct 内参基因
1.4 Western blot 检测蛋白表达
将 MM 细胞株用预冷强 RIPA 细胞裂解液（10 % PMSF）处理，提取总蛋白。 应用 BCA 蛋白定量试剂盒 （美国 Thermo Scientific 公司）测蛋白浓度：蛋白标准 品倍比稀释，实验样本 5 倍稀释，每个样品加入 A 液 200 ml，B 液为 A 液的 1／50，37 ℃反应 30 min，酶标 仪测 450 nm 波长 A 值，按照标准品绘制浓度曲线，计 算样本蛋白浓度。 内参照为 GAPDH，抗 KLF12 抗体 （美国 Abcam 公司，ab129459），抗 GAPDH 抗体（美 国 CST 公司，2118S）， 二抗 HRP 标记山羊抗小鼠抗 体 （美国 CST 公司，7074），ImageQuant LAS4010 成 像分析仪 （美国 GE Healthcare Life 公司）。 用 10 % SDS-PAGE 凝胶行蛋白电泳。
1 材料与方法
1.1 研究对象
2014 年 7 月至 2015 年 6 月就诊于我院淋巴瘤 诊疗中心的 MM 患者 15 例，另选健康人 5 名。所有临 床取材均为临床检查后剩余样本，经过我院伦理委员 会同意， 患者签署知情同意书。 分离样本 CD138+ 细 胞，方法见参考文献［6］。 分别应用美国 TargetScan 7.0 软件和美国 Pictar2007 软件预测 miR137 靶基因， 合并两个软件的结果得到靶基因。 应用基因表达谱 （gene expression profiling，GEP）基因芯片分析 KLF12 （KLF12 214276_at）与 MM 预后的关系，以及在健康 供者、单克隆球蛋白病（MGUS）、冒烟型骨髓瘤、TT2 或 TT3 方案治疗的 MM 患者中 KLF12 表达量差异［7］， 该基因芯片由本课题组美国爱荷华大学湛凤凰教授 提供，芯片采用样本来自上述正常供者以及患者骨髓 CD138+ 细胞提取的 RNA。
【Abstract】 Objective To explore the prognostic impact of miR137 target gene Kruppel-like transcription factor 12 (KLF12) in multiple myeloma (MM). Methods The target genes of miR137 were predicted by software. The GFP analysis of KLF12 and the prognosis of MM were constructed. Overexpressing miR137 in MM NCI-H929 cell line was also constructed. Real-time qPCR and Western blot were used to detect the expression of KLF12 in this cell line. Results The target genes of miR137 were MITF, BUE2H, SH3BP5 and KLF12. High expression of KLF12 in 455 patients included 75 patients (16.5 %) died, 104 patients with low expression of KLF12, and 25 patients (24.0 %) died, but no significance was detected in the different subgroups. KLF12 expression was higher in MM NCI-H929 cell line with miR137 over expression. The expression of miR137 was positively correlated with the expression of KLF12. Conclusion miR137-KLF12 is an important index to judge the prognosis of MM.
DOI：10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2016.06.002
【摘要】 目的 探讨 miR137 的靶基因 Kruppel 样转录因子 12（KLF12）对多发性骨髓瘤（MM）预 后的影响。 方法 通过软件预测 miR137 的靶基因，应用基因表达谱（GEP）分析 KLF12 基因是否为 MM 预后因素，构建 miR137 过表达的 MM 细胞株 NCI-H929，应用实时定量聚合酶链反应、Western blot 分别 检测 KLF12 基因和蛋白在 细胞株中的表达。 结 果 软 件 预 测 miR137 的 靶 基 因 有 MITF、BUE2H、 SH3BP5、KLF12。 对 GEP 芯片中患者数据进行分析，高表达 KLF12 的患者 455 例，其中 75 例（16.5 %） 死亡，低表达 KLF12 的患者 104 例，其中 25 例（24.0 %）死亡。 miR137 过表达的细胞株 NCI-H929 中 KLF12 较高。MM 患者的 miR137 水平和 KLF12 的表达呈正相关（r＝0.67，P＝0.01）。结论 miR137-KLF12 是判断 MM 预后的重要指标。
抑制特定的靶基因， 参与细胞增殖、 分化和凋亡。 miR137 在黑色素瘤、 结直肠癌等多种恶性肿瘤中表 达降低，过表达 miR137 可以发挥其抑癌基因作用［3］。 Kruppel 样转录因子（Kruppel-like factor，KLF）是一类 具有锌指结构的转录因子，其典型结构特征是其羧基
白血病·淋巴瘤 2016 年 6 月第 25 卷第 6 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, June 2016, Vol. 25, No. 6
多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞恶性肿瘤，占 所有恶性血液病的 10 %。 现阶段 MM 是无法根本治 愈的，分析其预后因素对治疗 MM 显得尤为重要［1-2］。 微 RNA（miRNA）是一类长度约 22 个碱基的非编码 小 RNA，它可以在转录后水平调控基因的表达，从而
1.2 细胞株及其培养
MM 细胞株 NCI-H929 购自美国典型培养物保存 中心（ATCC）。 用含 10 % 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养液（美国 Gibco 公司），在 37 ℃、5 % CO2、 饱和湿度下培养。 构建 miR137 过表达质粒和空白对 照质粒，包装慢病毒，分别感染 NCI-H929 细胞，分别 为表达 miR137 的 NCI-H929 miR137 OE 细胞株和空 白对照 NCI-H929 miR137 EV 细胞株：在 12 孔板中铺 1×105 个／孔 NCI-H929 细胞；取病毒贮液 100 μl，加 入含 polybrene（5～8 μg／ml）的培养液中，总 体积 0.5 ml；弃除旧的培养液，加入含病毒培养液，4 ℃置 2 h 后，37 ℃过夜；次日晨换完全培养液继续培养 48 h。 扩大培养后，流式细胞术分选。
【关键词】 多发性骨髓瘤； miR137； Kruppel 样转录因子 基金项目：国家自然科学基金面上项目（81172255）
Expression of miR137 and its target gene Kruppel-like transcription factor 12 in multiple myeloma and their prognostic value Zhang Shuaishuai, Xu Yan, Deng Shuhui, Qin Yu, Du Chenxing, Mao Xuehan, Qiu Lugui State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, China Academy Medical Science and Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China Corresponding author: Qiu Lugui, Email: drqiu99@medmail.com.cn
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端具有 3 个 C2H2 锌指结构，KLF 基因的表达贯穿在 整个生命活动中，在细胞增殖、凋亡、分化以及胚胎发 育中发挥着重要的作用。 KLF12 基因是 miR137 的一 个靶基因，在 KLF 家族中有举足轻重的地位，在脂类 物质代谢中重要的转录因子，在糖尿病的发生发展中 发挥重要的调节作用［4］。 本研究通过分析 KLF12 和 miR137 在 MM 中的表达情况， 并对有关的临床资料 进行分析，从而系统性判断 miR137-KLF12 与 MM 患 者预后的关系［5］。
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白血病·淋巴瘤 2016 年 6 月第 25 卷第 6 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, June 2016, Vol. 25, No. 6
·论著·
miR137及其靶基因 Kruppel 样转录因子 12 在多发性骨髓瘤中的表达及预后意义
张帅帅 徐燕 邓书会 秦宇 杜晨星 毛雪涵 邱录贵 300020 天津， 中国医学科学院 北京协和医学院 血液学研究所 血液病医院 实验血液 学国家重点实验室 通信作者：邱录贵，Email：drqiu99@medmail.com.cn
1.3 实时定量聚合酶链反应（PCR）检测各 基因表达
TRIzol 法提取分选后的 MM 患者、健康人 CD138+ 细胞或者 NCI-H929 细胞，采用 Nanotrop2000 超微量 分光光度计测定吸光度（A）260 值、A280 值。 A260／A280
比值在 1.7～2.0， 说明纯度尚可， 适合 PCR 实验。 miR137 以 U6 为内参照，二者引物由美国 Genecopoeia 公 司 合 成 ， 反 转 录 合 成 cDNA 及 PCR 参 考 美 国 Genecopoeia 公司 All-in-One miRNA qRT-PCR Reagent Kit 说明书进行。 KLF12 反转录 cDNA 的合成及 PCR 扩增参考北京全式金生物技术有限公司说明书进行， 上游引物 5'-CCTTTCCATAGCCAGAGCAG-3'，下游引 物 5'-TTGCATCCCTCAAAATCACA-3'， 以 GAPDH 为 内参照，上游引物 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'， 下 游 引 物 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。 反 转 录：总 RNA 2 μg，2.5 U／μl PolyA 聚合酶 1 μl，RTase Mix 1 μl，5XPAP／RT Buffer 5 μl，Spike-in control 1 μl，混匀，37 ℃反应 60 min，85 ℃反应 5 min。 实时 定 量 PCR：ddH2O 3.6 μl，2 ×All-in-One qPCR Mix 10 μl，Universal Adaptor PCR Primer（U6，2 μmol／L） 2 μl，miR-137 qPCR Primer （2 μmol／L）2 μl，1st strand cDNA （5 倍稀释液）2 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，混匀；应用 Gene Amp PCRsystem7500 PCR 扩增仪（美国 Ambion RNA 公司），反应条件为预变 性 95 ℃ 10 min，1 个循环；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 10 s，40 个循环。 以 2-ΔCt 为目的基因 相对表达量。
ΔCt＝Ct 目的基因 -Ct 内参基因
1.4 Western blot 检测蛋白表达
将 MM 细胞株用预冷强 RIPA 细胞裂解液（10 % PMSF）处理，提取总蛋白。 应用 BCA 蛋白定量试剂盒 （美国 Thermo Scientific 公司）测蛋白浓度：蛋白标准 品倍比稀释，实验样本 5 倍稀释，每个样品加入 A 液 200 ml，B 液为 A 液的 1／50，37 ℃反应 30 min，酶标 仪测 450 nm 波长 A 值，按照标准品绘制浓度曲线，计 算样本蛋白浓度。 内参照为 GAPDH，抗 KLF12 抗体 （美国 Abcam 公司，ab129459），抗 GAPDH 抗体（美 国 CST 公司，2118S）， 二抗 HRP 标记山羊抗小鼠抗 体 （美国 CST 公司，7074），ImageQuant LAS4010 成 像分析仪 （美国 GE Healthcare Life 公司）。 用 10 % SDS-PAGE 凝胶行蛋白电泳。
1 材料与方法
1.1 研究对象
2014 年 7 月至 2015 年 6 月就诊于我院淋巴瘤 诊疗中心的 MM 患者 15 例，另选健康人 5 名。所有临 床取材均为临床检查后剩余样本，经过我院伦理委员 会同意， 患者签署知情同意书。 分离样本 CD138+ 细 胞，方法见参考文献［6］。 分别应用美国 TargetScan 7.0 软件和美国 Pictar2007 软件预测 miR137 靶基因， 合并两个软件的结果得到靶基因。 应用基因表达谱 （gene expression profiling，GEP）基因芯片分析 KLF12 （KLF12 214276_at）与 MM 预后的关系，以及在健康 供者、单克隆球蛋白病（MGUS）、冒烟型骨髓瘤、TT2 或 TT3 方案治疗的 MM 患者中 KLF12 表达量差异［7］， 该基因芯片由本课题组美国爱荷华大学湛凤凰教授 提供，芯片采用样本来自上述正常供者以及患者骨髓 CD138+ 细胞提取的 RNA。
【Abstract】 Objective To explore the prognostic impact of miR137 target gene Kruppel-like transcription factor 12 (KLF12) in multiple myeloma (MM). Methods The target genes of miR137 were predicted by software. The GFP analysis of KLF12 and the prognosis of MM were constructed. Overexpressing miR137 in MM NCI-H929 cell line was also constructed. Real-time qPCR and Western blot were used to detect the expression of KLF12 in this cell line. Results The target genes of miR137 were MITF, BUE2H, SH3BP5 and KLF12. High expression of KLF12 in 455 patients included 75 patients (16.5 %) died, 104 patients with low expression of KLF12, and 25 patients (24.0 %) died, but no significance was detected in the different subgroups. KLF12 expression was higher in MM NCI-H929 cell line with miR137 over expression. The expression of miR137 was positively correlated with the expression of KLF12. Conclusion miR137-KLF12 is an important index to judge the prognosis of MM.
DOI：10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2016.06.002
【摘要】 目的 探讨 miR137 的靶基因 Kruppel 样转录因子 12（KLF12）对多发性骨髓瘤（MM）预 后的影响。 方法 通过软件预测 miR137 的靶基因，应用基因表达谱（GEP）分析 KLF12 基因是否为 MM 预后因素，构建 miR137 过表达的 MM 细胞株 NCI-H929，应用实时定量聚合酶链反应、Western blot 分别 检测 KLF12 基因和蛋白在 细胞株中的表达。 结 果 软 件 预 测 miR137 的 靶 基 因 有 MITF、BUE2H、 SH3BP5、KLF12。 对 GEP 芯片中患者数据进行分析，高表达 KLF12 的患者 455 例，其中 75 例（16.5 %） 死亡，低表达 KLF12 的患者 104 例，其中 25 例（24.0 %）死亡。 miR137 过表达的细胞株 NCI-H929 中 KLF12 较高。MM 患者的 miR137 水平和 KLF12 的表达呈正相关（r＝0.67，P＝0.01）。结论 miR137-KLF12 是判断 MM 预后的重要指标。
抑制特定的靶基因， 参与细胞增殖、 分化和凋亡。 miR137 在黑色素瘤、 结直肠癌等多种恶性肿瘤中表 达降低，过表达 miR137 可以发挥其抑癌基因作用［3］。 Kruppel 样转录因子（Kruppel-like factor，KLF）是一类 具有锌指结构的转录因子，其典型结构特征是其羧基
白血病·淋巴瘤 2016 年 6 月第 25 卷第 6 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, June 2016, Vol. 25, No. 6