紫苏FAD3与FAD7基因沉默表达载体的构建及其转化方案

紫苏FAD3与FAD7基因沉默表达载体的构建及
其转化方案
PfFAD3基因RNAi载体构建方案
FPfFAD3I 5’- GGATCCGACGTCCGCCGTCTTCGCGCTGCT-3’ （18nt, Tm= 66.5，对应于PfFAD3 ORF 的222-239bp，5’引入一个BamH I:和一个AatⅡ位点）
RPfFAD3I 5’- TCTAGACCATGGTGGTGGTGAGTTCTATGGCTG-3’ （21nt,T m= 59.0，对应于PfFAD3 ORF的435-455bp，5’引入一个Xba I和一个Nco I位点）
扩增cDNA片段的长度为234 bp（计酶切位点258bp），为PfFAD3与PfFAD7基因在ORF内无显著同源性区段。

反义片段采用AatⅡ+Nco I完全酶切亚克隆到pFGC5941M中CaMV 35S启动子与BnPAP2 Intron II之间，正义片段采用BamH I+Xba I完全酶切亚克隆到pFGC5941M中BnPAP2 Intron II 与OCS 3’之间。

（以包含PfFAD3 ORF并经测序正确的质粒为模板，TA克隆并经测序验证后，提取其质粒，先用AatⅡ+ Nco I完全酶切基因片段和pFGC5941M，连接转化后，再用BamH I+Xba I酶切，回收骨架，连接BamH I+Xba I酶切的基因片段。

）
鉴定方法：
1、采用F35S3ND与FPfFAD3I扩增片段约400 bp 图：右F3I-F35S
2、采用RPA3ND与RPfFAD3I扩增片段约900 bp 图：baocuntu3E10
3、采用F35S3ND和RPA3ND扩增片段约图：验证3E10-20-23-24（FR）
4、采用Fbar和Rbar扩增片段约图：验证3E10-20-23-24（FR）
PfFAD7基因RNAi载体构建方案
FPfFAD7I 5’- TCTAGAGACGTCCCAGTA TCTCTCCAATTCCAACC-3’ （23nt, Tm= 57.5，对应于PfFAD7 ORF的72-94bp，5’引入一个Xba I和一个Aat II位点）
RPfFAD7I 5’- ACTAGTGGCGCGCCAGATAGGCCAAACAGCCCAG-3’ （21nt,T m= 59.3，对应于PfFAD3 ORF的420-439bp，5’引入一个Spe I和一个Asc I位点）
扩增cDNA片段的长度为368bp（计酶切位点394bp），为PfFAD7与PfFAD3基因在ORF内无显著同源性区段。

反义片段采用Aat II+Asc I完全酶切亚克隆到pFGC5941M中CaMV 35S启动子与BnPAP2 Intron II之间，正义片段采用Xba I+ Spe I完全酶切亚克隆到pFGC5941M中BnPAP2 Intron II与OCS 3’之间。

鉴定方法：
1、采用F35S3ND与FPfFAD7I扩增片段约500 bp 图：右3IF35S-F7I-F35S
2、采用RPA3ND与RPfFAD7I扩增片段约1000 bp 图：M7E 验证
3、采用F35S3ND和RPA3ND扩增片段约图：右侧3E-7E171820FR
4、采用Fbar和Rbar扩增片段约图：验证3E10-20-7E17-20
5、采用Aat II+Asc I和Xba I+ Spe I双酶切，片段约370 bp
Nco I：CCA TGG Asc I：GGCGCGCC AatⅡ：GACGTC
BamH I: GGATCC XbaI:TCTAGA SpeI:ACTAGT
均用Fermentas的限制性内切酶，1Xbuffer Tango，37℃酶切约3h。

1.1引物设计
FPfFAD3I 5’- GGATCCGACGTCCGCCGTCTTCGCGCTGCT-3’
（18nt, Tm= 66.5，对应于PfFAD3 ORF的222-239bp，5’引入一个BamH I:和一个AatⅡ位点）RPfFAD3I 5’- TCTAGACCA TGGTGGTGGTGAGTTCTATGGCTG-3’
（21nt,Tm= 59.0，对应于PfFAD3 ORF的435-455bp，5’引入一个Xba I和一个Nco I位点）FPfFAD7I 5’- TCTAGAGACGTCCCAGTA TCTCTCCAATTCCAACC-3’
（23nt, Tm= 57.5，对应于PfFAD7 ORF的72-94bp，5’引入一个Xba I和一个Aat II位点）RPfFAD7I 5’- ACTAGTGGCGCGCCAGATAGGCCAAACAGCCCAG-3’
（21nt,T m= 59.3，对应于PfFAD3 ORF的420-439bp，5’引入一个Spe I和一个Asc I位点）
1.2目的基因扩增PCR体系（25μL）：
10×buffer 2.5μL10×buffer 2.5μL
dNTP 0.5μL dNTP 0.5μL
FPfFAD3I(10μmol/L)0.5μL FPfFAD7I(10μmol/L)0.5μL
RPfFAD3I 0.5μL RPfFAD7I 0.5μL
模板DNA 1μL模板DNA 1μL
Taq酶0.1μL Taq酶0.1μL
dd H2O 19.9μL dd H2O 19.9μL
94℃ 4min；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 45s，30个循环；72℃ 10min
经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.
M:Mark2000 1:FAD7I 2:FAD3I
1.3 纯化
切下目的条带进行胶回收.20-30μL洗脱
1.4 pUCM-T连接重组10μL体系
与pUCM-T连接重组成pUCM-T-FAD3I，与pUCM-T连接重组成pUCM-T-FAD7I FAD3I 7.5μL FAD7I 7.5μL
Pucm-T 0.5μL Pucm-T 0.5μL
Ligase Buffer 1μL Ligase Buffer 1μL
T4 DNA Ligase 1μL T4 DNA Ligase 1μL
16℃1h
1.5转化(阳性对照)
转化DH5a感受态细胞，抗Amp (100mg／L)、IPTG／X-gal筛选显白色的菌
转化：(10μL, 9μL连接液+1μL的SlutionIII)
(1)将pUCM-T-FAD3I/pUCM-T-FAD7I，与感受态细胞充分混合（超净台），冰冻30min。

不要振动
(2)42℃热击60-90s。

(3)冰浴3-5min.5
(4)加液体培养基1mL（无菌）
(5)37℃，200r 摇菌40-60min。

离心5000r，4min，常温。

吸900μL上清液去除，混匀后取
60μL
涂平板，37℃过夜培养。

1.6挑斑液体培养
每瓶40mlLB培养基加40μL Kan（浓度100μg/μL）
1.7鉴定
菌落液体培养物采用PCR鉴定，阳性克隆子送样进行引物的测序
10×buffer 2.5μL10×buffer 2.5μL
dNTP 0.5μL dNTP 0.5μL
FPfFAD3I(10μmol/L)0.5μL FPfFAD7I(10μmol/L)0.5μL
RPfFAD3I 0.5μL RPfFAD7I 0.5μL
模板DNA 1μL模板DNA 1μL
Taq酶0.1μL Taq酶0.1μL
dd H2O 19.9μL dd H2O 19.9μL
94℃ 5min；94℃ 30s 、56℃ 30s、72℃ 45s，35个循环；72℃ 10min。

经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
M:Mark2000 123:FAD3I M:Mark2000 123:FAD7I
2.1提质粒
分别抽提pFGC5941M和pUCM-T-FAD3I，pUCM-T-FAD7I。

洗脱200μL水。

电泳检测。

pUCM-T-FAD3I 离心管标记：3a、3h。

-80摄氏度冰箱
pUCM-T-FAD7I 离心管标记：7-5,、7-6。

-80摄氏度冰箱
2.2双酶切37℃3h （60μL体系）
10×buffer 6μl10×buffer 6μl
AatⅡ 1.5μL AatⅡ 1.5μL
Nco I 15.μL Nco I 15.μL
pFGC5941M 30μL pUCM-T-FAD3I 30μL
dd H2O 21μL dd H2O 21μL
10×buffer 6μl10×buffer 6μl
AatⅡ 1.5μL AatⅡ 1.5μL
Asc I 1.5μL Asc I 1.5μL
pFGC5941M 30μL pUCM-T-FAD7I 30μL
dd H2O21μL dd H2O21μL
M:Mark2000 1: pUCM-T-FAD3I质粒2: FAD3Ia 3: pUCM-T-FAD7I质粒4: FAD7Ia
M:Mark2000 1: pFGC5941M质粒2: pFGC5941M骨架3: pFGC5941M质粒4: pFGC5941M骨架2.3胶回收20-30μL洗脱
回收反义片段FAD3Ia和开环后的pFGC5941M骨架，
回收反义片段FAD7Ia和开环后的pFGC5941M骨架。

2.4
FAD3Ia 7.5μL FAD7Ia 7.5μL
pFGC5941M 0.5μL pFGC5941M 0.5μL
Ligase Buffer 1μL Lig Liase Buffer 1μL
T4 DNA Ligase 1μL T4 DNA Ligase 1μL
16℃, 1h
2.5转化(10μL, 9μL连接液+1μL的SlutionIII)
重组载体pFGC5941M-FAD3Ia转化DH5感受态细胞，涂Kan平板.
重组载体pFGC5941M-FAD7Ia转化DH5感受态细胞，涂Kan平板
2.6挑斑液体培养4×2
（灭菌：牙签，小三角瓶10，大的2个，灭菌后加kan ）
40mlLB培养基加40μL Kan（100μg/μL）
2.7 PCR鉴定8×2
10×buffer 2.5μL10×buffer 2.5μL
dNTP 0.5μL dNTP 0.5μL
FPfFAD3I(10μmol/L)0.5μL FPfFAD7I(10μmol/L)0.5μL
RPfFAD3I 0.5μL RPfFAD7I 0.5μL
pFGC5941M-FAD3Ia 1μL pFGC5941M-FAD7Ia 1μL
Taq酶0.1μL Taq酶0.1μL
dd H2O 19.9μL dd H2O 19.9μL
94℃ 5min；94℃ 30s、56℃30s、72℃ 45s，30个循环；72℃ 10 min
经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
M:Mark2000 123: pFGC5941M-FAD3Ia M:Mark2000 123: pFGC5941M-FAD7Ia 3.1 提质粒200μL水洗脱重组子pFGC5941M-FAD3Ia, 重组子pFGC5941M-FAD7Ia 重组子pFGC5941M-FAD3Ia 离心管标记：M-3a 2、M-3a 4; -80摄氏度冰箱
重组子pFGC5941M-FAD7Ia 离心管标记：M-7a B、M-7a D。

-80摄氏度冰箱
M:Mark2000 12: pFGC5941M-FAD3Ia质粒34: pFGC5941M-FAD7Ia质粒
3.2双酶切37℃ 3h （60μL体系）
采用BamH I+Xba I分别完全双酶切，pUCM-T-FAD3I和pFGC5941M-FAD3Ia质粒，10×buffer 6μL10×buffer 6μL
BamH I 2μL BamH I 2μL
Xba I 2μL Xba I 2μL
pUCM-T-FAD3I 30μL pFGC5941M-FAD3Ia 30μL
dd H2O 20μL dd H2O 20μL
采用Xba I+Spe I分别完全双酶切，pUCM-T-FAD7I和pFGC5941M-FAD7Ia质粒
10×buffer 6μL10×buffer 6μL
Spe I 2μL Spe I 2μL
Xba I 2μL Xba I 2μL
pUCM-T-FAD7I和H2O 30μL pFGC5941M-FAD7Ia和H2O 30μL
dd H2O 20μL dd H2O 20μL
M:Mark2000 1: pUCM-T-FAD3I质粒2: FAD3Is 3: pUCM-T-FAD7I质粒4: FAD7Is
M:Mark2000 1: pFGC5941M-FAD3Ia质粒2: pFGC5941M-FAD3Ia骨架3: pFGC5941M-FAD7Ia 质粒4: pFGC5941M-FAD7Ia骨架
3.3胶回收20-30μL洗脱
回收正义片FAD3Is和线状pFGC5941M-FAD3Ia骨架;
回收正义片FAD7Is和线状pFGC5941M-FAD7Ia骨架
3.4连接（20μL）（目的片段比载体5-8倍，不加水）
二者连接后得到重组质粒pFGC5941M-FAD3I，连接后得到重组质粒pFGC5941M-FAD7I FAD3Is 12μL FAD7Is 12μL
pFGC5941M-FAD3Ia 4μL pFGC5941M-FAD7Ia 4μL
Ligase Buffer 2μL Ligase Buffer 2μL
T4 DNA Ligase 2μL T4 DNA Ligase 2μL
16℃
3.5转化(10μL, 9μL连接液+1μL的SlutionIII)
10μL转化DH5ot，挑取抗Kan的单克隆菌落培养.
3.6 PCR鉴定
3.6.1 F35S3ND与FPfFAD3I/FPfFAD7I检测
pFGC5941M-FAD3I采用F35S3ND与FPfFAD3I扩增片段约400 bp ；
pFGC5941M-FAD3I采用F35S3ND与FPfFAD7I扩增片段约500 bp
10×buffer 2.5μL10×buffer 2.5μL dNTP 0.5μL dNTP 0.5μL FPfFAD3I(10μmol/L)0.5μL FPfFAD7I(10μmol/L)0.5μL F35S3ND 0.5μL F35S3ND 0.5μL pFGC5941M-FAD3I 1μL pFGC5941M-FAD7I 1μL
Taq酶0.1μL Taq酶0.1μL dd H2O 19.9μL dd H2O 19.9μL
94℃ 5min；94℃ 30s、56℃30s、72℃45s，30个循环；72℃ 10 min
经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
3.6.2 RPA3ND与RPfFAD3I/RPfFAD7I检测
pFGC5941M-FAD3I采用RPA3ND与RPfFAD3I扩增片段约1300 bp
pFGC5941M-FAD7I采用RPA3ND与RPfFAD7I扩增片段约1300 bp
PCR体系（25μL）：
10×buffer 2.5μL10×buffer 2.5μL dNTP 0.5μL dNTP 0.5μL R PfFAD3I(10μmo l/L) 0.5μL R PfFAD7I(10μmol/L)0.5μL RPA3ND 0.5μL RPA3ND 0.5μL pFGC5941M-FAD3I 1μL pFGC5941M-FAD7I 1μL
Taq酶0.1μL Taq酶0.1μL dd H2O 19.9μL dd H2O 19.9μL
94℃ 5min；94℃ 30s、56℃30s、72℃45s，30个循环；72℃ 10 min
经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
3.6.3 F35S3ND和RPA3ND检测
pFGC5941M-FAD3I采用F35S3ND和RPA3ND扩增片段约
pFGC5941M-FAD7I采用F35S3ND和RPA3ND扩增片段约
10×buffer 2.5μL10×buffer 2.5μL dNTP 0.5μL dNTP 0.5μL F35S3ND 0.5μL F35S3ND 0.5μL RPA3ND 0.5μL RPA3ND 0.5μL pFGC5941M-FAD3I 1μL pFGC5941M-FAD7I 1μL
Taq酶0.1μL Taq酶0.1μL dd H2O 19.9μL dd H2O 19.9μL
94℃ 5min；94℃ 30s、56℃30s、72℃45s，30个循环；72℃ 10 min
经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
3.6.4 Fbar和Rbar检测
pFGC5941M-FAD3I采用Fbar和Rbar扩增片段约
pFGC5941M-FAD7I采用Fbar和Rbar扩增片段约
10×buffer 2.5μL10×buffer 2.5μL
dNTP 0.5μL dNTP 0.5μL
Fbar 0.5μL Fbar 0.5μL
Rbar 0.5μL Rbar 0.5μL
pFGC5941M-FAD3I 1μL pFGC5941M-FAD7I 1μL
Taq酶0.1μL Taq酶0.1μL
dd H2O 19.9μL dd H2O 19.9μL
94℃ 5min；94℃ 30s、56℃30s、72℃45s，30个循环；72℃ 10 min
经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
3.7 抽提质粒
重组质粒pFGC5941M-FAD3I 离心管标记：M3E-10 ( ①②) -80摄氏度冰箱重组质粒pFGC5941M-FAD7I 离心管标记：M7E-17、M7E-20。

-80摄氏度冰箱
4．转化农杆菌
大肠杆菌阳性单克隆进行液体培养，抽提质粒pFGC5941M-FAD3I/pFGC5941M-FAD7I，转化根癌农杆菌感受态细胞，抗Kan(浓度1oomg／L) (1mL LB培养基里加l1μL)、Rif利福平(浓度40 mg／L) (1mL LB培养基里加l1μL)和Str链霉素(20 mg／L)的单克隆菌液进行PCR鉴定。

农杆菌pFGC5941M-FAD3I 离心管标记3EE -80摄氏度冰箱
农杆菌pFGC5941M-FAD7I 离心管标记7EE -80摄氏度冰箱
4.1农杆菌感受态细胞制备，采用改进的氯化钙二次重悬法：
1) 从-80℃储存的农杆菌菌株GV2301用接种环取菌液在LB平板上划线；
2) 从LB平板上挑取1 个单菌落接种于含有10 m LYEB液体培养基的100 mL三角瓶中，28℃，220 rpm 培养6 h以上至OD600=0.5左右；
3) 吸取300 μL菌液接种于另一个含有30mL YEB液体培养基的250mL三角瓶中，28 ℃，220 rpm培养约2.5-3 h 至OD600=0.4 左右；
4) 将菌液转入50mL无菌离心管中，冰水浴30 min；
5) 5000 rpm，4℃离心5 min，弃上清，用移液器吸干上清液；
6) 用6mL冰浴冷的CaCl2（20mmoL/L）轻轻重悬菌体至均匀，冰水浴10 min；
7)5000 rpm，4℃离心5 min，弃上清，将离心管倒置约1 min，再次控干管壁上的液滴；
8) 用2 mL冰浴冷的CaCl2（20mmol/L）轻轻重悬菌体至均匀，置于冰水浴中30 min；
9) 加50%甘油至终浓度12.5%—15%，用无菌的1.5 mL离心管分装成每管100 μL的小份，于-80 ℃保存；
10) 取出部分感受态细胞转化质粒，14 h后观察转化平板，检测转化效率，对感受性进行评价。

4.2超量表达载体转化农杆菌感受态细胞：
1) 取出－80℃保存的农杆菌菌株GV2301感受态（100 μL）细胞，冰水浴解冻；
2) 轻轻加入5 μL超量表达工程菌株质粒FGC5941M-FAD7I/ FGC5914M-FAD3I，用枪头轻轻混匀；
3) 冰水浴5 min，迅速用液氮冷激8 min，迅速放入37℃水浴，热激5 min；
6) 加入900 μL室温YEB（添加抗生素Str（25 mg•L-1）和Rif（50 mg•L-1））不加Kan,液体培养基，于28℃，210rpm振荡3–5 h复苏培养；
7) 复苏结束后于5000 rpm室温离心5 min；
8) 吸去900 μL上清，余下的100 μL重悬菌体，涂布于LB固体平板(添加抗生素Kan 50 mg•L-1、Str 25 mg•L-1、Rif 50 mg•L-1)上；
9) 将平板倒置于28℃培养2 d，至长出较大的菌落；
10) 用枪头挑取单克隆子，于YEB液体培养基（添加抗生素Kan 100mg•L-1、Str 25 mg•L-1、Rif 50 mg•L-1）中培养2 d；
11) 对培养菌液进行PCR检测，挑选阳性的菌液中加入加50%甘油至终浓度12.5%—15%，于-80℃，用于转化紫苏。

5农杆菌介导法转化紫苏
5.1农杆菌活化
(1)划板：用接种环挑取保存-80℃FGC5941M-FAD7I/ FGC5914M-FAD3I菌株，接种在YEP平板上划线，倒置于28℃培养箱中培养2d，直到有单菌落长出。

(2)一活：用牙签挑取单菌落，接种到50mLYEP液体培养基，过夜28℃，210rpm。

(3)二活：500μL菌液加入50mLYEP液体培养基中，摇床中振荡培养（28℃，210rmp）9-10h。

OD600=0.5。

(4)离心：将二活的菌液转入离心管中，冷冻离心机中离心5000rmp 5min，去掉上清液。

(5)悬浮：向离心管中加入50mL MS悬浮液，移液枪混匀菌体，在摇床中振荡培养1-2h(210rmp，28℃)，用于转化紫苏。

5.2 转化紫苏
5.2.1紫苏苗
1.在土壤中培养紫苏，28℃培养10天，将下胚轴以上剪下，75%乙醇浸泡1min，0.1%升汞8min。

2.将子叶切成0.5m2大小，置于农杆菌悬浮液中侵染3分钟，在滤纸上吸干多余菌液，背面向下置于共培养基中（加放滤纸），边缘尽可能接触培养基，暗培养2-3天。

MS+3.0mg/L 6-BA
3.将子叶从共培养基中取出，水洗2-3次后置于滤纸上吸去多余液体，然后将其放入选择培养基中，背面向下并且使边缘尽可能接触培养基。

每两周跟换一次培养基，直至有芽体长出。

MS+3.0mg/L 6-BA+500mg/L Cef
4.生根培养：等到芽体长至2-3cm左右，将芽切下插入生根培养基生根培养。

5. 驯化移栽：待再生苗长大后，对其进行炼苗，使其逐渐适应外界环境。

然后再将再生苗移栽到花盆中，在适宜的环境下培养。

MS。