凝血实验的标准化和质量控制问题

凝血实验的标准化和质量控制问题

由于血栓与止血实验的特殊性，故迄今为止仅有凝血酶原时间（prothrombin time, PT）、活化的部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, APTT）和纤维蛋白原(fibrinogen,FG) 等三项实验有了标准化的试剂（如PT）、标准品（如Fg）、质控品和统一的报告形式等，其他，如血小板功能、抗凝因子和纤溶因子等检测尚缺乏成熟的标准化方案。本文就经国际血液学标准化委员会（ICSH）和国际血栓与止血委员会(ICTH) 或美国国家临床生化室标准委员会(NCCLS) 等国际组织以文件形式公布的PT、APTT和Fg三项实验的标准化和质量控制问题作一简介。

一、标准化和质量控制的重要性

所谓血栓与止血检测方法的质量控制（质控），是指采用统计学原理，运用物理、化学、生物学的方法，对血栓与止血实验室的技术、操作、仪器、试剂等项的质量水平，进行合理的检测、评价和指导改进，以堵绝误差，提高质量而言。

血栓与止血实验质控的目的，在于提高血栓与止血实验的可靠性。可靠性首先取决于检测结果的精密度（主要靠实验室内部质控保证），其次取决于检测结果的准确度（主要靠实验室外部质控保证）。质量控制的重要性在于：

1.为临床诊治提供可靠的依据# 实验结果若为假阳性就会造成误诊、误治；若为假阴性就

会造成漏诊、漏治；实验结果偏高或偏低都会影响患者的病情和疗效的判断。

2.提高血栓与止血基础研究的效率和价值# 血栓与止血基础研究的形式就是进行各种实

验。实验可靠性好，就能揭示血栓与止血的客观规律，甚至可带来重大理论突破及（或）社会、经济效益；若实验可靠性差或有错误，则不仅费时、费力，徒劳无功，还会造成假象或错误理论。

3.有助于人群健康调查和建立血液学参数的正常范围# 为了解一定人群的健康水平，建立

具有广泛意义的血液学参考值的范围须进行较大规模人群的健康调查，健康调查必须要有实验结果的可靠性作保障，不然会导致不准确或错误的结果，故质量控制对群体医学也有重要意义。

总之，血栓与止血实验室的质量控制，从一定程度上反映一个国家，一个地区，一个单位血栓与止血医疗水平和研究水平的高低。因此，应倍加重视。

二、凝血酶原时间（PT）

（一）PT的标准化问题

自从1953年Quick建立了PT测定方法以来，至今仍然是检查外源凝血系统诸因子及相关抑制物的重要筛选试验，并且是监测口服抗凝药治疗的主要手段。

PT测定受很多因素影响，诸如标本的采集方法及器材，储血容器的性质，抗凝剂的种类和用量，标本的运送和储存条件，孵育温度及时间，凝血活酶试剂的种类和质量（敏感性）以及判读终点的方法等，均会影响测定结果。此外，报告结果的方式也必须统一，特别是用于监测口服抗凝药物治疗时。所有这一切，都必须使方法标准化和建立有效的质量控制。

早在1973年，在维也纳召开的第四届血栓与止血国际会议上，由ICSH和ICTH联合成立了口服抗凝药控制专家组（Expert Panel on Oral Anticoagulant Control），要求该组制订推荐一个PT测定标准化方案。经过多个实验室的协作研究，在1975年该专家组提出了第一个人血一期凝血酶原时间试验参考方法（reference method for the one-stage prothrombin time test on human blood）并于1976年发表（编号ICSH-EP14/1：1975）。该文件重点是讲标

本采集和PT的测定方法，对于报告结果和质量控制只简单地提了几句。而至关重要的PT 试剂——凝血活酶的标准化问题，当时虽然注意到，但因条件尚未成熟，仅答应进一步研究完成后再修订。众所周知，不同的凝血活酶，检测相关的凝血因子缺乏的敏感性是不同的。因此要使PT标准化，使不同的实验室虽用了不同的凝血活酶，也能得到同样的（可比的）结果。

此后，经过几个著名实验室历时数年的共同努力，并由世界卫生组织（WHO）参与，以当时已在英国作为统一标准使用的“英国比较凝血活酶”（british comparative thromboplastin, 简称BCT）为基础，制备了WHO的原级凝血活酶参考品(primary reference preparation) 人脑制品，编号67/40；同时制备了牛脑（68/434）和兔脑（70/178）两个用67/40标化的次级参考品（secondary reference preparation）。后来，WHO又发表了其他一些次级参考品，迄今已在世界各国广泛用于校正本地制备或工厂生产的PT参考物。

与此同时，在口服抗凝药物治疗中，用PT监测时的报告方式也列入了议事日程。如上所述，各种凝血活酶对凝血因子有不同的敏感性。为了使不同敏感性的试剂得到同样的测试结果，首先要制定一个共同的敏感性指标。这就要通过用自制的试剂与IRP进行比较后，得到一个校正值。具体的做法是：用多份口服抗凝药后不同程度地缺乏凝血因子的病人血浆和正常对照（至少混合10个正常人）的血浆，同时用自制凝血活酶和国际参考品（IRP）测定PT（结果用秒表示），分别计算出各自与正常对照血浆的比率。然后在双对数纸上作图，以IRP的比率为纵坐标，自制凝血活酶的比率为横坐标，通过回归分析，其回归线的斜率称为国际敏感指数（international sensitivityindex, ISI）。此数值愈低PT试剂愈低敏感（人脑制的原级标准作为1.0）。

从理论上讲，不管何种凝血活酶，只要标上ISI，就可以与国际参考制品进行对比校正，并可用同一种计量单位报告。1985年，ICSH和ICTH发表了在口服抗凝药监测中推荐的PT 报告方式(即ICSH/ICTH recommendations for reporting protrombin time in oral anticoagulant control)。该文件提出用国际标准化比率（international normalized ratio, INR）来报告PT试验结果，INR的计算公式如下：

INR=PTR ISI

式中PTR表示患者的PT与正常对照PT的比值；ISI为国际敏感指数。

文件要求试剂厂家每批凝血活酶试剂都必须标明ISI值，以便使用者计算INR。目前各国在口服华法令类抗凝药物时，已广泛使用INR作为控制用药量的指标。

在用INR以后，各种敏感性不同的凝血活酶均可得到相同的INR值，这对于用手工法（倾斜试管法）测定PT值并用手工法测定PT来讲是正确的。但后来发现，手工与仪器以及仪器与仪器之间，INR仍有差别。为此，等提出建议，同一凝血活酶试剂用于不同的仪器时，可用所谓“仪器特有的ISI”（instrument specific ISIs）来计算INR。WHO在发放IRP 时，亦附上这种仪器特有的ISI。

除了ICSH、ICTH和WHO发布的有关PT测定标准化的文件以外，1992年美国的NCCLS 也发表了编号为H28-T的有关PT测定标准化的文件。本文以下将综和上述文件，提出我国PT测定标准化和质量控制的方案，供讨论。

（二）凝血酶原时间（PT）的推荐方法

[原理]将凝血活酶（主要含组织因子和脂质）和钙离子，加到枸橼酸抗凝血浆中，在37ºС保温，测定血浆凝固时间，即为PT。本法主要用于过筛检测外源凝血途径的第Ⅶ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ因子和相关因子的抑制物。

[试剂]

1、抗凝剂 109mmol/L枸橼酸钠液（相当于含二分子结晶水的枸橼酸钠32g/L）。