第六章——植物组培脱毒
浅谈组培苗的脱毒及应用
浅谈组培苗的脱毒及应用植物在生长过程中几乎都会受到病毒的侵染，尤其是无性繁殖的植物，病毒严重影响果树、蔬菜、花卉和树木等植物的生长发育，造成产量降低、品质下降，严重时甚至造成植物的死亡，给农业生产造成巨大的经济损失，全世界每年因病毒造成的经济损失中，粮食作物达200 亿美元，经济作物达600 亿美元[1]。
第九次国际病毒委员会公布的病毒数量达到了2000 多种，归属于6 个目87 个科19 个亚科349 个属。
1 植物病毒的传播方式及为害病毒的传播途径多种多种，如昆虫传播、土壤传播、机械传播、无性繁殖材料传播，甚至有些病毒可以通过种子传播。
植物感染病毒之后主要表现为内部症状和外部症状2 个方面：内部症状主要有组织病变坏死、茎部微管组织和叶部坏死、产生激素、引起组织增生或产生各种类型的内含体，植物正常的生理代谢受到干扰，叶绿素、花青素及激素等的产生受到改变；外部症状主要有变色、坏死、畸形等相应的异常症状。
植物感染病毒造成的经济损失是比较大的，如葡萄的扇叶病毒可使葡萄每年减产10%～15%，非洲可可树的肿枝病可使产量减少50%以上，马铃薯的退化病毒可使产量减少50%～70%。
对于观赏性的植物，病毒导致花朵变少变小，甚至畸形、变色，从而失去观赏价值。
2 植物脱毒的方式2.1 茎尖分生组织培养脱毒1952 年Morel 等从感染花叶病毒和斑萎病毒的大丽花植株上切取茎尖分生组织进行培养，并获得脱毒苗。
茎尖分生组织培养脱毒苗是利用了病毒在植物体内分布不均匀的特点，病毒主要通过微管组织进行转移，而茎尖不含有微管系统，茎尖中的叶原基能分泌生长素抑制病毒的增殖，所以茎尖几乎不含有病毒或病毒的浓度很低，通过剥离茎尖或根尖进行培养，可获得脱毒苗。
剥去茎尖的大小是脱毒的关键，一般剥取0.1～1mm 茎尖进行培养，茎尖太小难于成活，茎尖太大脱毒效果差。
何新民等[2]对“红姑娘2 号”甘薯进行培养和脱毒研究，结果表明，剥去茎尖0.3～0.5mm 时，脱毒率为100%，当剥去茎尖0.6～0.8mm 时，脱毒率为93.3%。
组培育种脱毒技术
植物组培脱毒技术属于组培技术里比较有技术性和高价值性的衍生技术。
这里的脱毒不是十二卷圈子里的“脱毒”两者意义完全不同，后者是玩家自己编的，前者是一项很厉害的育种技术。
本次经一个师兄提点开始重新了解这项技术，以前都只是略微了解其理论，现在需要往更深的方向发展了。
本次参考文献：植物组培脱毒技术及其在花卉生产上的应用植物里的毒脱毒技术最主要脱的毒指的是病毒，绝大多数植物种类是靠无性繁殖的，由于病毒也是通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，导致植物种性退化严重，其表现为植物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，现阶段花卉生产上往往都是通过无性繁殖手段，而其规模巨大，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。
由于病毒是潜伏性的，并能通过无性繁殖手段转移到同样无性繁殖的植物子株上，且没有特效药物治理，为此前人通过另外寻找途径去避免病毒，20世纪50年代，科学家们发现，通过利用植物组织培养的方法可以生产出完全不带病毒的植株，这样就不会有后代携带病毒的问题了。
植物脱毒技术的最本质原理整个植物脱毒技术围绕的一个原理就是，用一个检测完全没有病毒的植物组织，重新培育出一颗新植株，那么我们认定这颗植株应该是无毒的，后期再通过检测手段检测是否有病毒存在，如果没有那么证明脱毒成功。
植物组培脱毒技术的发展历程脱毒技术的出现就是映射上面的原理1.White 于 1943 年首先发现，在感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒，并且病毒的含量随植株部位和年龄而异。
2.Morel 等在White的实验结果启示下，于1952 年利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养，得到了无毒株。
3.1952年后，根据这一模式通过茎尖组培的方法，有100多种植物也成功获得了无毒植株，其中马铃薯的脱毒技术是最成功的。
4.20世纪70年代，一批新的脱毒技术涌现，脱毒不在局限于茎尖脱毒。
植物组培脱毒技术及在花卉上的应用
组织培养技术在名贵花卉上的应用前景摘要：综述了组织培养技术的形成、研究进展、意义及其应用植物组培脱毒技术的培养条件，并重点阐述了组织培养方法及其在名贵花卉上的应用以及病毒检测的重要性，最后浅析了组织培养技术存在的问题及展望。
关键词：组织培养；名贵花卉；应用；病毒检测；前景1组织培养技术概述1．1组织培养技术的形成危害植物的病毒、植物菌原体、类细菌有几百种，果树、花卉、蔬菜等植物病毒也不下500多种，绝大多数植物种类是靠无性繁殖的，由于病毒通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，种性退化严重，表现为植物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。
自从2O世纪5O年代发现通过植物组织培养的方法，可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢复种性，提高产量、质量，组织培养脱毒技术便在生产实践中得到广泛应用，且有不少国家已将其纳入常规良种繁育体系，有的还专门建立了大规模的无病毒苗生产基地。
1．2组织培养技术研究进展white于1943年首先发现，在感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒，并且病毒的含量随植株部位和年龄而异。
Morel等在这个启示下，于1952年利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养，得到了无毒植株。
自1952年以来，通过茎尖分生组织培养或热处理与分生组织培养结合的方法获得成功的实例有100余种，其中最成功的实例之一是马铃薯的脱毒培养Ⅲ。
随着植物细胞培养技术的发展，2O世纪5O年代末通过愈伤组织培养脱毒获得成功。
7O年代初植物原生质体培养成完整的植株，为利用原生质体培育无毒植株提供了可能性。
1975年Shepard_5 通过对瘟染病毒的烟草原生质体的培养得到了无毒植株。
1972年Navarro等将果树嫁接方法与茎尖分生组织培养法两者有机结合，创立了一种新的植物组织培养脱毒技术，即茎尖显微嫁接法。
植物组织培养课件第6章B-植物脱毒
茎尖不带病毒原因：
I 病毒通过维管系统移动，分生组织中不存在维管系统
II 竞争机制：茎尖分生组织中，代谢活性高，竞争中病毒 复制处于劣势
III 病毒钝化系统在茎尖分生组织内活性最高
IV 分生组织内高水平的内源激素抑制病毒的增殖
大 茎尖
脱毒效果差， 脱毒效果差，成苗易 脱毒效果好， 脱毒效果好，成苗难
指 示 植 物 穗 接
嫁接后 的植物
②抗血清(antisemm)鉴定法 抗血清 鉴定法 利用了“ 血清反应” 利用了 “ 血清反应 ” ， 用已知抗血清可以 鉴定未知病毒“抗原” 鉴定未知病毒“抗原” 特点： 特异性高； 测定速度快， 特点 ： 特异性高 ； 测定速度快 ， 一般几小 时甚至几分钟就可以完成； 时甚至几分钟就可以完成； 植物病毒鉴定中最有用的方法之一
II 植株热处理脱毒法 试验母株在高温生长室中生长一段时 间，其顶端分生组织比次生分生组织生长 迅速， 迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培 养。 生长室温度35—40℃ 生长室温度 ℃ 光照3000—10000 lx 光照
评价： 评价：利用了病毒的热敏性 i、并非所有病毒都有热敏性； 、并非所有病毒都有热敏性； ii、热处理影响母体植株存活率； 、热处理影响母体植株存活率；
小（0.1－1.0mm） － ）
在满足培养材料 成苗的前提下， 成苗的前提下， 茎尖越小越好
茎尖
小茎尖
顶端分生组织 小茎尖：顶端分生组织+叶原基（1-2个），大小为0.1mm-1mm
香石竹（康乃馨）脱毒的具体操作过和如下： 香石竹（康乃馨）脱毒的具体操作过和如下： （1）热处理 将盆栽植株或离体瓶苗，在 36～38℃下处理2周，或每天在36℃16小时和 38℃8小时处理共30天，光照为3000lx。 （2）表面消毒 选取盆栽香石竹植株叶腋间生 出的侧芽为外植体，先用自来水冲洗半小时， 用75%的酒精消毒30秒，再用2.5%次氯酸钙 或次氯酸钠溶液处理15分钟,取出后用无菌蒸 馏水清洗4次,用无菌滤纸吸去多余水分备用。
植物脱毒组培的方法和原理
植物脱毒组培的方法和原理
植物脱毒组培是一种通过细胞或组织培养技术去除植物组织中的病毒或其他病原体的方法。
其方法包括以下几个步骤：
1. 选择合适的母本植株：选择健康没有病毒污染的植物作为母本植株。
2. 提取母本组织：从母本植株中提取出组织，如叶片、茎段、种子等。
3. 建立细胞或组织培养：将提取的组织转移到营养培养基上，提供适宜的营养物质和激素，促使组织细胞分裂和生长。
4. 建立病毒感染模型：将营养培养基中加入病毒悬浮液或病毒感染的植物部分，使细胞或组织感染上病毒。
5. 选择抗病株系：在病毒感染的条件下，筛选出能够抵抗病毒感染的细胞或组织，这些细胞或组织可以表现出无病毒或低病毒含量的状态。
6. 培养和繁殖抗病株系：将筛选出的抗病细胞或组织进行继代培养，使其继续增殖和繁殖。
植物脱毒组培的原理主要基于以下几个方面：
1. 细胞或组织培养条件的控制：适宜的培养基成分和激素浓度能够促进细胞分裂和生长，同时也能够改变细胞的物质代谢和
抵抗能力，有利于抗病性的培养。
2. 细胞再分化的能力：在培养条件下，植物组织细胞有再分化为器官样组织的能力，可以通过再分化获得无病毒细胞或组织。
3. 病毒感染的选择性：某些植物病毒在体内能够引起明显的病症，但在体外无法复制，通过在体外培养条件下去除病毒复制的环境，可以选择出无病毒的细胞或组织。
4. 细胞或组织的抗病机制：植物组织细胞通过产生抗病蛋白、抗氧化物质等手段，形成对病毒感染的抵抗能力，通过培养和筛选可以选择出具有这种抗病机制的细胞或组织。
植物脱毒组培方法的应用可以用于繁殖无病毒植株、培育新品种、保存稀有植物等。
组织培养脱毒
组织培养脱毒植物组织培养脱毒是目前广泛应用和正在继续发展的主要脱毒方法。
依据的原理是病毒在植物体内分布的不均匀及细胞全能型，如在植物茎尖等分裂旺盛、生长迅速的组织细胞往往检测不到病毒的存在。
采用不含病毒的植物组织或细胞进行组织培养，获得无病毒的植株。
将组织培养脱毒技术与基因工程、品种改良和植物快繁结合起来，利用工厂化育苗，达到快速获得品性优良的无毒种源，具有广阔的开发和应用前景。
3.3.2.1茎尖组织培养脱毒Morel等（1952）从侵染花叶病毒的大丽花的茎尖组织培养获得无病毒的植株，从此茎尖培养成为脱毒的一个有效途径，在马铃薯、兰花、百合、鸢尾、苹果等植物中获得了脱毒成功。
利用茎尖脱毒技术，能够将很多不能通过热处理脱除的病毒脱掉，同时茎尖脱毒获得的植株遗传变异小，能够很好的保持品种的特性。
葡萄脱毒与快繁工艺流程图(摘自曹孜义，2001)3.3.2.2茎尖微芽嫁接脱毒茎尖微芽嫁接脱毒是将组织培养与嫁接相结合，来获得无毒植株的一种新方法，它是将0.1-0.3mm的茎尖作为接穗嫁接到组织培养获得的无毒实生砧木上，再进行试管培养，愈合成为完整的脱毒植株。
该方法可以解决一些果树茎尖组培成苗的困难。
另外，在柑橘等茎尖培养过程中可能发生芽变，出现返祖现象，而茎尖嫁接则不出现这些想象。
3.3.2.3其他组培脱毒方法植株中除茎尖含病毒较少外，花药、胚、胚珠及珠心等组织器官都几乎不含病毒，以这些组织器官为外植体进行组织培养也可以获得无病毒植株。
3.3.2.3.1花药培养法大泽胜次等(1974)首先发现草毒花药培养可脱除病毒，且草莓花药培养与热处理、茎尖组织培养比较，具有脱毒率高，安全可靠等优点。
其后对枸杞、苹果、葡萄、莴苣、玉米等药用植物、果树及蔬菜、农作物进行花药脱毒取得了成功。
3.3.2.3.2珠心胚培养法柑桔的种子具有多胚性，其中有一个胚是受精后产生的有性胚，其余是珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。
珠心胚经培养后可以得到无病毒的珠心胚苗。
植物组织培养脱毒方法综述
植物组织培养脱毒方法综述摘要：植物病毒是制约花卉产业发展的重要因素，通过茎尖处理、茎尖结合热处理、冷处理、化学药剂处理及愈伤组织处理等方法可以去除植物病毒。
通过查阅国内外研究文献和资料，综合阐述了茎尖培养脱毒、热处理脱毒、化学药剂培养脱毒、愈伤组织脱毒、冷处理脱毒等方法。
关键词：组织培养；脱毒；茎尖培养正文：植物病毒分布广、危害大，对世界花卉产业的发展产生了巨大的冲击。
近年来。
随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术，病毒病开始流行，严重影响了中国花卉产业的发展。
目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。
因此，本文对当前植物组织培养脱病毒方法作了综述，以期从中得到启示，进一步促进植物脱毒方法及应用的相关研究。
植物组织培养脱毒方法有茎尖培养脱毒、热处理脱毒、冷处理脱毒、化学药剂处理脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等，其中由于茎尖培养脱毒效果好，是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径。
研究表明，如果将不同的方法结合起来应用效果会更好，通常将茎尖结合热处理来脱毒。
1、茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒原理：在染病毒植株体内，病毒分布并不均匀，在生长点病毒含量最低。
病毒通过维管束和胞间连丝传播，在分生区内无维管束，病毒扩散慢，加之植物细胞不断分裂增生，所以病毒含量少，在茎尖生长点几乎检测不出病毒，因此切取茎尖愈小愈好，但实际操作中茎尖取太小不易培养成活，过大又不能去毒。
1．1 茎尖培养的方法及注意事项将消毒后的材料放置在20～40倍解剖显微镜下，用解剖刀剥取0．1～1 mm 的茎尖，迅速放入培养基中，如果在空气中暴露时间过长，就会因失水引起茎尖死亡。
赵军良等人的研究表明，带有一个叶原基的茎尖，脱毒效果最好，成活率最高[3]。
不同的植物材料茎尖剥取的方法和最适合脱毒的茎尖大小不同。
在菊花的茎尖培养中，在超净工作台内将消毒后的茎尖中用肉眼能看到的叶柄切除，在实体解剖镜下用解剖刀剥离顶芽至露出带有1～2片叶原基的生长点，生长点大小约在0.3～0.5 mm左右。
植物组培脱毒技术及在花卉上的应用
植物组织培养课程作业植物组培脱毒技术及在花卉上的应用摘要：综述了植物组培脱毒技术的形成、研究进展、意义及其应用植物组培脱毒技术的培养条件，并重点阐述了植物组培脱毒方法及其在花卉上的应用以及病毒检测的重要性，最后浅析了植物组培脱毒技术存在的问题及展望。
关键词：植物组培脱毒；花卉；应用；病毒检测英文摘要：Methods of plant tissue introduces, the formation of the research progress and application, meaning plant tissue culture conditions of virus-free techniques, and focuses on plant tissue in the flower method and its overviews of the application and the importance of virus detection, and finally analyses the plant tissue introduces existing problems and prospect.1 植物组培脱毒技术概述1．1 植物组培脱毒技术的形成危害植物的病毒、植物菌原体、类细菌有几百种，果树、花卉、蔬菜等植物病毒也不下500多种，绝大多数植物种类是靠无性繁殖的，由于病毒通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，种性退化严重，表现为植物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。
自从2O世纪5O年代发现通过植物组织培养的方法，可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢复种性，提高产量、质量，组织培养脱毒技术便在生产实践中得到广泛应用，且有不少国家已将其纳入常规良种繁育体系，有的还专门建立了大规模的无病毒苗生产基地。
7.3植物组培快繁和脱毒技术
鉴定方法
1、直观测定法 2、指示植物法
利用病毒在其他植物上 出现症状的特征，作为 鉴别病毒种类的标准， 这种专门用以生产症状 的寄主植物即为指示植 物，又称鉴别寄主。
3、抗血清鉴定法
4、酶联免疫吸附法（ELISA） 5、电子显微镜检查法
6、免疫吸附电镜法
• 另一种是起源于苗基部切口处愈伤组织的上部，直接起源于中柱 鞘细胞，由于发生与茎的中柱相连，故利于移栽成活。
胚状体形成
• 概念： 离体培养下起源 于非合子细胞，经历 了胚胎发生和胚胎发 育过程所形成的类胚 结构。
原球茎形成
3、试管苗的增殖与继代培养
• 1）、试管繁殖速率及计算
• 理论计算：
接种一个芽或一块增殖的培养物，经一段时间的培养后看能 得到多少个芽或苗，从而推算理论上一年能繁殖出多少苗。
第一节 植物的离体快繁
植物离体快繁（Micropropagation） 又叫微型繁殖或试管繁殖，它是把植物 材料放在试管内，给予人工培养基和合 适培养条件，达到高速增殖，属离体无 性繁殖。
其特点是快速，每年能以千百万倍
一 .离体快繁的应用
良种快繁 脱毒良种苗快繁和无病毒苗大量快繁； 特殊育种材料快繁； 制种材料快速繁殖； 自然和人工诱变有用突变体的快繁； 基因工程植株的快繁；
四、离体快繁中的有关问题
• 培养物的增殖方式 • 外源生长调节物质对品种典 型性的影响 • 继代次数与变异
第二节 术
• 怎样脱毒？
植物的组培脱毒技
• 为什么要脱毒？
• 怎样鉴定无病毒植株？
病毒不仅使人患病，同样也侵害植物，使植物出现皱叶、黄 叶、落叶，以致品质变劣、花色变淡、花数减少、产量降低。 多数农作物，特别是无性繁殖作物，都易受到一种或多种病原 菌的周身浸染。病原菌的浸染不一定都会造成植物的死亡，很多病 毒甚至可能不表现任何可见症状。但在植物中病毒的存在会减少作 物的产量和降低作物的品质。
第六章——植物组培脱毒
植物脱毒的方法
• 1、通过热处理消除病毒 • 基本原理： • 在高于正常的某一温度范围（35－40℃)下，植物组织中的很多病毒可被部分地或完
全钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。 • 病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能
钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。 • 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。
易感病毒园艺作物常见病毒种类
植物组培脱毒实验的作用：
1、能够有效地保持优良品种的优良性状。 任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖可以很好 地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。 2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用。 组培快繁繁殖周期短，不受季节限制，繁殖系数高，繁殖速度是任何其 他方法所不能比的。 3、生产无病毒种苗，防止品种退化。 4、提高农产品的商品率，节约耕地，便于运输。 离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。
植物脱毒的方法
3，通过茎尖培养消除病菌 1）原理及依据 病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少； 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争。 2）操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基 上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。
植物脱毒的方法 • 茎尖脱毒可以使用茎尖为外植体，也可以使用茎的顶端分生组织为外植
茎尖
3.2剥取茎尖的方法
• 工具：解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。 • 为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。 • 茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒（10分钟）。 • 在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，
大学课程植物组织培养13植物脱毒--组培课件
二 茎尖脱毒技术的原理和方法
1 基本原理（采用茎尖的原理）
利用病毒在植物体内的分布不均匀性，一般情况下，病毒 在植物的顶端分生组织中不存在或只有较低的浓度（胚中也是 这种情况，为什么？）
2病毒分配不均匀性的可能原因：
A 物理隔离：分生组织微管系统或胞间连丝不发达，细胞分 裂速度快于病毒侵染速度
B能量竞争 ：病毒核酸和植物细胞分裂时都须要消耗大量的 能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是 自我提供能量自我复制，这样病毒核酸复制就得不 到足够的能量。
D 植物病毒结构 植物病毒结构简单，杆状、线条状的病毒，粒体中间 是螺旋状的核酸链，外面是蛋白质亚基组成的衣壳。
E 植物病毒的发展简史 1．症状描述期
2．病原研究期 代表人物：Adolf mayer（1882）， Dmitrii Ivanowski（1892），Martinus Beijernek （1898）。
3 植物脱毒技术概念：
A 广义：消除包括病毒、真菌、细菌在内的微生物病原体 B 狭义：单指消除植物细胞、组织内的病毒、类病毒
（本节重点为狭义脱毒所涉及内容）
4 植物脱毒技术的一般方法： A 从材料角度分：
茎尖培养脱毒（或顶端分生组织）、珠心胚培养脱毒、 微尖嫁接脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织培养脱毒
C 存在病毒钝化系统：植物不同部位细胞的防卫系统能力的 差别。
D 抑制因子存在
2 基本步骤 （1）母体的选择 （2）母体（预）处理 （3）茎尖的分离 （4）茎尖的培养和小批量快繁 （5）效果检验 （6）大批量快繁及无毒原种保存。
2 基本步骤 （1）母体的选择
欲脱毒材料的品种典型性
植体健康程度选择
织细胞。
A
B
植物组织培养项目六 植物脱毒技术
5）电镜检测法
用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否 有病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、形状（ 杆状、线状、球状）和结构。
二、脱毒苗的保存
1. 隔离保存：避免脱毒苗再次感染病毒，脱毒
苗需隔离与保存，最好将无病毒母本园建立
在相对隔离的山上（300 目的防虫网室），
管理得当可保存5 ~ 10 年。
2. 长期保存
将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种在 培养基上，低温离体保存。
1）低温保存： 1-9 ℃ 的低温、并低光照保存，只需半 年或1年更换1次培养基（最小生长法）
2）冷冻保存（超低温保存）：液氮（-196 ℃）
①材料选择
植方式移入蛭石、河沙、椰壳等基质中培养。
3. 理化方法脱毒
1）物理方法
① 高温处理（热处理 / 温热疗法）：病毒对热
不稳定，高于常温的温度（ 35-40 ℃ ）下钝
化失活。
温汤处理：50 ℃左右热水中浸泡数分钟至几 小时（适用于离体材料和休眠器官的处理）
热风处理：盆栽植物移入室内或生长箱中， 35-40 ℃
2）茎尖大小与脱毒效果：顶端分生组织即生长点（最大直
径0.1 mm）；也可是带1-3个幼叶原基的茎尖（0.3-0.5 mm） 最适合作外植体，脱毒效果好。
方法
1）取样与消毒：取植株顶芽或侧芽梢段 消毒方法：剪取顶芽梢段（侧芽） 3-5 cm 。剥去大
叶，自来水冲洗干净，用 75%酒精浸泡 30 s左右，再
处理几十分钟至数月。 处理温度和处理时间因植物种类、器官类别、生理状 况、待脱除病毒的种类等而异。 变温处理可消除病毒但不伤及植物。
植物组培热处理脱毒原理
植物组培热处理脱毒原理
植物组培热处理脱毒是一种常见的植物组织培养技术，其原理是通过高温杀菌的方式，去除植物体内的病毒、细菌和真菌等微生物，使植物能够得到更好的生长和发育。
组织培养是指从植物体中取出一小段组织，经过适当处理后，培养在含有营养物质和
激素的培养基中，使其在无菌条件下生长和分化。
组织培养技术已被广泛应用于植物的疫苗、生根和繁殖等方面，大大促进了植物研究和生产的发展。
然而，在进行组织培养技术时，植物体内常常存在各种病毒、细菌和真菌等微生物。
这些微生物往往会对植物的生长和发育造成严重的危害，导致组织死亡、变色和凋萎等现象，从而影响培养的效果。
因此，在进行组织培养时，必须进行脱毒处理，以确保培养的
顺利进行。
植物组培热处理脱毒就是一种常见的脱毒处理方法。
它的原理是利用高温杀菌的方式，将培养物暴露在高温环境中，使其中的病毒、细菌和真菌等微生物被彻底杀死。
一般来说，热处理温度一般为55℃~60℃，时间约为30min~60min。
具体操作步骤如下：
1. 将已经准备好的培养物放入培养瓶中，加入适当的脱毒液（如未加糖的MS培养基）。
2. 将培养瓶密封好，放入加热设备中进行热处理。
3. 培养瓶中的培养物应保持水平，避免挤压和震荡，以免造成组织的损伤。
4. 热处理完成后，将培养物取出，置于标准的组织培养环境中，等待其生长和发
育。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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分生组织为什么能逃避病毒的侵染？
可能的原因有： ①在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。 病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃 生长的茎尖； ②、在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制； ③、倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他 区域都有更高的活性，因而分生组织不受侵染； ④、在茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。
基中6-BA的浓度可形成大量从生芽。 4．生根诱导
诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2 个月可生根。
脱毒马铃薯试管苗
影响茎尖脱毒效果的因素
• （一）培养基
• MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。不同植物茎尖培养，可以在 MS培养基成分上做相应调整。
用于脱毒的适宜茎尖大小
影响茎尖脱毒效果的因素
• 优缺点： • 茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但同时因为
其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要求就越高，对 剥离技术要求也越高。
影响茎尖脱毒效果的因素
• 除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株 的能力。大黄离体顶端分生组织必须带有2～3个叶原基。Mrashige （1970）等虽然证实了不带叶原基的离体顶端分生组织有可能进行无 限生长，并发育成完整的植株，但他们认为，叶原基能向分生组织提供 生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节剂的 培养基中，离体顶端分生组织可能在组织重建过程中迅速形成双极性轴。 虽然培养不带叶原基的顶端分生组织是可能的，但对于脱毒来说，看来 并不实际可行。正如Murashige所说的，“如果培养方法得当，用较大 的茎尖做外植体，其消毒的效果并不一定比只用分生组织差。”
• 草莓：
• 草莓病毒病为害面广，多表现为花叶、黄边、皱叶和斑驳，病株矮化， 多数农作物，特别是无性繁殖作物，都 易受到一种或一种以上病原菌的周身浸 染。例如，已知草莓能感染62种病毒 和类菌质体，因而每年都必须更新母株。 病原菌的侵染不一定都会造成植物的死 亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见 症状。然而，在植物中病毒的存在会减 少作物的产量和（或）品质。据报道， 当以特定的无毒植株取代了被病毒侵染 的母株之后，产量最多可增加 300％ （平均为30％）。
影响茎尖脱毒效果的因素
（三） 培养条件 在茎尖培养中光照培养通常都比暗培养的效果好。在马铃薯中建立茎尖 培养物的最适光照强度是100lx，但4周后应增加到200lx。当茎已长到 1cm高时，光照强度应进一步增加到4000lx。 温度通常是25℃+2℃。
植物脱毒的方法
• 例如： • 在草莓中，将热处理（36℃,6周）与茎尖培养结合起来，比单独茎尖培养对于消除
温性黄边病菌更有效。在大多数的草莓品种中，热处理还能提高植株的生长速率。 • 马铃薯S病毒（PVS）和马铃（PVX）是两种常见的马铃薯病毒，单独通过热疗法或
单独通过茎尖培养都不容易消除。然而，通过培养经过热处理的植株上的茎尖，已在 几个马铃薯品种中消除了这两种非常稳定的病毒。
脱毒技术与无病毒苗
• 所谓脱毒就是采用一定的方法除去植物体内病毒的技术，最常采用的组培脱毒技术是 茎尖培养；茎尖培养不但可以去病毒，而且可以去掉所有的病原菌(包括细菌、真菌 等）。
• 通过大量的实验以后，茎尖培养方法得到了长足的发展，现以成为最有效的获得无毒 植物的方法，成功的用于多种栽培植物。现在这一方法已在园艺上得到了普遍应用。 在茎尖培养法建立之前，在活体上消除病毒的方法是对整个植株进行热处理。
茎尖
3.2剥取茎尖的方法
• 工具：解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。 • 为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。 • 茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒（10分钟）。 • 在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，
另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。当形似一个透明闪亮的半球形顶 端分生组织暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来， 上面可以带有叶原基，也可不带，然后用同一工具接种到培养基上。 • 注意，不要太大，以免带有较老的组织。
易感病毒园艺作物常见病毒种类
植物组培脱毒实验的作用：
1、能够有效地保持优良品种的优良性状。 任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖可以很好 地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。 2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用。 组培快繁繁殖周期短，不受季节限制，繁殖系数高，繁殖速度是任何其 他方法所不能比的。 3、生产无病毒种苗，防止品种退化。 4、提高农产品的商品率，节约耕地，便于运输。 离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。
植物脱毒的方法
• 1、通过热处理消除病毒 • 基本原理： • 在高于正常的某一温度范围（35－40℃)下，植物组织中的很多病毒可被部分地或完
全钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。 • 病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能
钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。 • 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。
• 虽然较大的茎尖外植体（500μm或更长）在不含生长调节剂的培养基中也能产生一 些完整的植株，但一般来说，含有少量的（0.1－0.5mg/L）生长素，细胞分裂素， 或二者皆有常常是有利的。
• 在各种不同的生长素中，应当避免使用2，4－D，因为它通常能诱导外植体形成愈 伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。
植物脱毒的方法
热处理的优缺点 优点: 方法简单，效果明显。 缺点: 1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒 （马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。 2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失 3)延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降 低处理效果。
3.3 茎尖脱毒组培流程 • 1）取样与消毒
可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种 。
• 消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净， 在75%酒精中浸泡30秒左右，用1-3%次氯酸钠或5-7%的漂白粉溶液 消毒10-20分钟，最后用无菌水冲洗材料4-5次。
• 试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生 长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。
• 通常采用：生长室温度35-40℃，光照3000—10000 lx
植物脱毒的方法
• 热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求为止。若钝化 病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的 效果。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。而且要对植物进行修 剪，以增加植物忍受热处理的能力。
植物脱毒的方法
植物脱毒的方法
• 例如： • 香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个月处理可除去全部病毒。 • 马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶病毒。
植物脱毒的方法
• 2，热空气处理后，离体快繁脱毒法
• 热处理，可通过热水或热空气进行。 热水对休眠芽效果较好；热空气对活跃 生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使寄主植物又较高的存活机会。 热空气处理比较容易进行：把旺盛生长的植物移入到一个热疗室中，在 35~40℃处理一定时间即可。处理时间的长短，可由几分钟到数周不等。
植物脱毒的方法
3，通过茎尖培养消除病菌 1）原理及依据 病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少； 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争。 2）操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基 上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。
植物脱毒的方法 • 茎尖脱毒可以使用茎尖为外植体，也可以使用茎的顶端分生组织为外植
植物脱毒苗的意义：
• 但是，若一个无性系的整个群体 都已受到侵染，获得无病植株的 惟一办法，就是由该植株的无病 毒组织，通过组织培养，再生出 无病毒的完整植株。
植物的什么地方的组织不易感染病毒呢？
• 众所周知，病毒在植物体内的分布是不均匀的。 • 在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有
体。
• 茎顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约为 100um，最大长度约为250um。
• 茎尖是由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的。
• 虽然通过顶端分生组织培养消除病毒的机会较高，但在大多数已发表的 的工作中，无毒植物都是通过茎尖培养得到的。
3.1茎尖与顶端分生组织：
影响茎尖脱毒效果的因素 • （二）外植体大小
• 在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大， 产生再生植株的机会也就越多，在木薯中，只有200 μm长的外植体能 够形成完整的植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小 外植体可能也不利于茎的生根。然而，不应当离开脱毒效率（它与外植 体的大小呈负相关）单独看待外植体的存活率，因此，外植体应小到足 以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。
3.3 茎尖脱毒组培流程
• 2、茎尖剥离和接种 • 将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上，器械固定，解剖镜下剥去幼叶，
切下带1-2个叶原基的生长点（0.3-0.5mm）—切下的茎尖转至培养基 上（顶部向上）。
3.3 茎尖脱毒组培流程
3．培养 25+2℃ ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新鲜培养基。提高培养