烟草瞬时转化实验步骤

烟草叶片瞬时转化实验

试验方法

一、实验材料及药品

pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等

二、载体构建及农杆菌转化

烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。

通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。

三、材料的准备

1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株

2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）

3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）

4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：

0.5M MES 200ul 0.976g

1M MgCl2100ul 2.03g

100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）

灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）

四、操作步骤

1、农杆菌转化

2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）

3、确定不同农杆菌所加菌液的量：

计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600

OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。

4、将计算出的各菌液体积进行混匀（此时各菌液实际浓度比例为1:1:1），5000rpm，5min

5、弃上清，用Vfinal（2ml或3ml）悬浮液进行悬浮，随后室温避光放置3h

6、利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（注射烟草顶端以下第3-5片叶片）

7、暗培养1d，转入光照培养1-2d

8、利用稀释好的荧光素酶底物喷施到叶片上，黑暗下放置1-2min，随后利用CCD 冷冻相机进行观察。

荧光素酶的配置：固体0.032g溶解于1ml 灭菌水中，用前吸取该溶液100ul 稀释到10ml水中，并加入10ul Triton-X-100（全程避光）。