兔抗鸡IgG荧光抗体的制备及应用

Ｈ ｉｒ 箱 Ｂ Ｄ １６ ， 净 工 作 台 （ 州 净 化 ａ 冰 ｅ Ｃ 一９Ｆ超 苏 设 备公 司 ）Ｔ Ｌ １ Ｃ台式高 速 离心 机 （ ，Ｇ 一６ 金坛 市 医疗 仪器 厂 制造 ）Ｈ ， Ｊ控 温磁 力 搅 拌 器 （ 苏 医疗 仪 器 江
毒、 菌、 细 立克 次体 、 生 动物 及 真菌 以及抗 各 种微 原 生 物抗 体 的检 测 。近 年来 ， 疫荧 光 技 术在 兽 医科 免 学 上 的应用 比较普 遍 ， 别是 对 一些 流 行严 重 的家 特
１ ｍ ｎ后 弃 去 ， 标本 保持 一 定 的湿度 ， 后 滴加 适 ０ｉ 使 然 当稀释 的荧光 标记 的抗 体溶 液 ， 其完 全覆 盖标 本 ； 使
置 于有 盖搪瓷 盒 内 ， 温 ３ ｍ ｎ后 取 出玻 片 ， 保 ０ ｉ 置玻 片 架 上 ， 用 ０ １ ｏ／、Ｈ ． 先 ． ｔｌ ｐ ７ ０ｏ １ ４的 Ｐ Ｓ冲洗 后 ， 按 顺 Ｂ 再
１ 材 料 与 方 法
１１ 试 验 材料 ．
１１ １ 试 验 动 物 ．．
生理 盐 水 ，使 之 溶 解 ，再 加 （ Ｈ ） Ｏ 饱 和 溶 液 Ｎ ２ Ｓ １ ｍ ， 之 成 ３ ％（ Ｈ ） ０ 溶 液 ， 分 混 合 ， 置 ０ ｌ使 ３ Ｎ ２ Ｓ 充 静
３ ｍ ｎ后 ３Ｏ ０ ｍ ｎ离心 ２ ｍ ｎ 弃 上 清 ， 除去 白 ０ｉ ０ｄ ｉ ０ ｉ， 以 蛋白， 将此过 程重 复 ２ ３次。然后用 １ ｎ ～ ０ ｄ生理盐 水 溶解 沉淀 ， 入 透析 袋 ， 析除 盐 ， 常水 中透析 过 装 透 在 夜 （ 节 常水 的 ｐ ７ ） 再在 生理 盐水 中于 ４ 调 Ｈ． ， ０ ℃透析
１２． 。４ 兔 Ｉ Ｇ 的提 取 与 浓 缩 ｇ
待 检 标本 加 鸡 大 肠 杆 菌 Ｋ ７ ２ ６ ０１８荧 光 抗 体 置 湿盒 内 ３ ℃作 用 ３ ｍ ｎ 以 Ｐ Ｓ液 冲洗 ， 检 ， 出 ７ ０ ｉ， Ｂ 镜 发 明亮 的荧光 ， 阳性 。 呈 阴性 标本 和 自发荧 光对 照无荧
中 圈分 类 号 ： ８ ２４３ ￥ ５ ．＊
文 献 标 识 码 ： Ｂ
左 右 ） 。
１ １２ 试 验 试 剂 ．．
文章 编 号 ：０ ３ ４ ８ ｛０ １ ０ — ０ ４ ０ １０ － ８ ９ ２ １ ）３ ０ ３— ３
硫 酸饱 和溶 液 ， 灭菌 生理 盐水 ，Ｈ ． Ｐ Ｓ缓 ｐ ７４的 Ｂ 免 疫 荧 光 技 术 是标 记 免 疫 技术 中发 展 最 早 的
Ｄ Ａ 一 维 素层 析 柱 ，这 就 导致 提 取 的 ＩＧ不 纯 ， Ｅ Ｅ 纤 ｇ 经 过异 硫氰 酸荧 光素 染 色的 ＩＧ在荧 光显 微镜 下 观 ｇ 察 到有 其他 蛋 白也被 着色 ， 响观察 结果 。 影 但制 备 的 大 肠杆 菌玻 片经过 荧 光抗体 检测 后发 现 ，大肠 杆菌 的周 围出现 了 明亮 的 黄绿色 荧光 ，而 制备 的猪 和人
伊宁
８ ５０ ） ３ ０ ０
摘要 ： 本试 验 通 过 提 取 鸡 的免 疫球 蛋 白 （ Ｏ） 与 弗氏 完 全 佐 剂按 照 １ Ｉ ， ｇ ： 比例 免 疫 兔子 ３次 ， 后提 取 兔 的 ＩＧ 并 经过 异 １的 然 ｓ
硫 氰 酸 荧 光 素 染 色。 经检 测 ， 备 出的 兔抗 鸡 ＩＧ 荧光 抗 体敏 感性 高 、 异 性 强 ， 比较 理 想 的检 测试 剂。 制 ｇ 特 是 关 键 词 ： Ｇ； 氏 完全 佐 剂 ； 硫 氰 酸 荧光 素 ； 光 抗体 Ｉ 弗 ｇ 异 荧
新 的途 径『 １ １ 。免疫 荧光 抗 体技 术 已用 于 多种 禽 病抗
原 或 抗 体 的 检测 ，成 为禽 病 诊 断 的 常 用血 清 学手
段。
１２ 试 验方 法 ．
１ 术 在病 毒 学检 验 中有 重 要 意义 ， 因
在无菌条件下取 ２ ｍ 鸡血清 ， ０ｌ 加生理盐水 ２ ｌ ０ ｎ， ｒ 再 逐 滴 加 入 （ Ｈ ） Ｏ 饱 和溶 液 ｌｍ ， 之 成 ２ ％ Ｎ ４ Ｓ Ｏ ｌ使 ０ （ Ｈ ） Ｏ 溶 液 ， 加边 搅拌 ， 分混 合 ， Ｎ ２ Ｓ 边 充 静置 ３ ｍｉ ０ ｎ 后 ３Ｏ ０／ ｎ离 心 ２ ｍ ｎ 弃 去沉 淀 ， ０ ｒ ｍｉ ０ ｉ， 以除去 纤维 蛋
白。 在上 清液 中加 （ Ｉ ） ０ 饱和溶 液 ３ ｍ ， 再 Ｎ４ ２ ４Ｓ Ｏ ｌ使之
为普 通 光学 显 微镜 看不 到 病毒 ， 用荧 光 抗体 染 色法
可 检 出病 毒及 其 繁殖情 况 。在寄 生 虫感 染诊 断 中 ， 间接 荧光 抗体 染色法 有非 常广 泛 的应 用 。在 本次 试
兔抗鸡 ＩＧ荧光 抗体 的制备及应用 ｇ
车凤 琴 ， 国柱 ， 徐 王传 锋
（． 勒克县 畜牧 兽 医工作站 ， 疆 １ 尼 新 尼 勒克 ８５０ ； ３ ７ ０
２博 州动 物疾病 控制 与诊 断 中心 ， 疆 ． 新 ３伊 犁 州职 业技 术 学院 ， 疆 ． 新
博乐
８３ ０ ； ３ ４ ０
抗体 对该 缓 冲液充 分透析 ， 以使赖 氨酸 不解 离 ， 后 然
将 透 析 袋 放 入 １０ ｌ含 ０１／ ＩＣ 的 ｐ ． ０ｍ ．ｇ ］ＦＴ Ｈ９８ Ｎ Ｃ 冲液 的烧 杯 中 ，用 铝箔 包 烧杯 避 光 ，℃ ａ Ｏ缓 Ｈ ４
的黄绿 色荧 光 ； ＋ 体呈 清 晰但 较 暗 的荧 光 ； 菌体 ＋菌 ＋ 呈勉 强 可见 的荧光 ； 菌体 不发 生荧 光【 一 ３ Ｉ 。
３ 讨 论
搅拌 过 夜 一 上述 抗体 液对 Ｐ Ｓ在 ４ｃ 析 以终 止 反 Ｂ ｃ透
应 ， 间 至 少更 换 Ｐ Ｓ液 ３次 ， 至 ４ ０ ｍ 的 吸 收 其 Ｂ 直 ８ｎ
本 试验 从免 的高 免血 清 中提 取 ＩＣ，并 将其 标 ｇ 记荧 光 素 （Ｉ Ｃ ， ＦＴ ） 制备 出 了兔抗 鸡 ＩＧ荧 光 抗体 ， ｇ 该 抗体 能够 检测 鸡 的 ｌＧ。其荧 光抗 体染 色冰 冻切 片 ， ｇ 均能 看到 特异 性荧 光 ， 态清 楚 ， 明制 备 的荧光 抗 形 说
一
冲液 ， ａ Ｃ ３ 冲液 （ ５ ｍ ｌＮ ２Ｏ ＂ａ Ｃ ３ ＮＨ Ｏ 缓 ２ ｍ ｏ／ ａ ｙ Ｈ Ｏ 缓 １ Ｃ Ｎ 冲液 ｐ ９８ 新 鲜配 制 ） 叠氮 钠 （ 毒 ） 异硫 氰 酸荧 Ｈ ．， ， 有 ， 光素 ， 氏完 全佐 剂 （ 配 ） 甘油缓 冲液 （ 弗 现 ， 现配 ） 。
２ ｈ 中间换 液 数 次 ， 以 Ｉ ａ １检 查 透 析 液 中 的 ４， 并 ％Ｂ Ｃｚ Ｓ ４或 以纳 氏试 剂 检 查 Ｎ （ ３ ４ ｌ 析 液 ， Ｏｚ 一 Ｈ 取 －ｍ 透 加
片覆盖 并立 即用 荧光 显微 镜 观察 。
２ 结果 与 分 析 ２ １ ＩＧ 含 量 ． ｇ
１１ ３ 试 验 仪 器 ．．
种， 很早 以来 就 有学 者试 图将抗 体 分 子与 一 些示
踪 物质 结合 ， 用 抗原 抗 体反 应 的特 异 性进 行 组织 利
或 细胞 内抗原 物质 的定位 。免疫荧 光技 术可 应用 于
生 物学 的各 个 领域 ， 微 生物 学 主要 将 其应 用 于病 在
验 中， 本人 主 要制 备兔 抗 鸡 免疫 球蛋 白荧光 抗 体并
对鸡 的大肠杆 菌进行 检￣ ｔ Ｊ ｌ。 ２ １
成 ５ ％ （ Ｈ ） ０ 溶 液 ， 分 混 合 ， 置 ３ ｒ ｎ后 ０ Ｎ ２ ｓ 充 静 ０ｉ ａ ３０ ０／ ｉ ０ ｒ ｎ离心 ２ ｍ ｎ 弃上清 。再于沉淀 中加 ２ ｌ ｍ ０ ｉ， ０Ｉ Ｉ ｌ
２２ ＩＧ 的 染色 ． ｇ 经 过染 色后 的 ＩＧ呈 黄绿 色 。 ｇ
２３ 荧 光 抗 体 的 特 异 性 ．
用 聚 乙 二 醇 ２ ０ ０ ０ ０包 埋 装 有 ＩＧ 的 透 析 袋 ｇ
２ ， 可 得 到 浓 缩 的 ＩＧ。 ｈ即 ｇ
１２３ 高免 血 清的制备 ＿． 将抗 原 （ 的免疫球 蛋 白） 鸡 与弗 氏完全佐 剂按 １ ： １的 比例在 兔 的颈 部 和 背部 皮 下 及 足跎 部 注射 ， 时 间顺序 为第 １ １ 、０天 。 、４ ３
厂 ）ＨＧ ６ ６型 电热 恒 温两用 箱 （ ， ７— 长沙 市西 区起 重
电器 厂 ） ，荧 光 显 微 镜 （ ｔ ｏ ｅ： Ｇ— ０ Ｂ Ｍｉｃ Ｍ ｄ ｌ ｉ ＭＨ ｌ０
９ ６ ２ ２ ） ０ １５ ０ 。
畜 、 禽及 其他 动 物传 染 病 的快速 诊 断 提供 了一条 家
进一 步 的研究 之 中 。
４ 结 论 在 试 验 过 程 中 ， 由 于 实 验 条 件 有 限 ， 没 有
干保 存 ，或加 Ｏ０ ％硫柳 汞在 普 通冰 箱或 低 温冰箱 ．１
保存 ， 意防止 反复 冻融 。 注
１２ ７ ＿． 检 测 方 法
滴加 ００ ｔｏ １ｐ ７４的 Ｐ Ｓ于待检 标 本 片上 ， ．１ ｌ 、Ｈ ． ｏ ／ Ｂ
猪大 肠 杆菌 及人 大 肠杆 菌 的玻 片标 本进 行 检 测 （ 以 荧 光 显 微 镜 下 观 察 出 现 “ ” 异性 荧 光 判 为 阳性 ， ＋ 特
无 特异性 荧光 判 为阴性 ） 。
１２６ Ｉ Ｇ 的 保 存 ＿＿ ｇ
一
２ ｈ左 右 ， 作 简单 ， 补 了其他 检测 方法 过 程 复杂 、 操 弥
费时 费力 的缺 陷 。 Ｊ
由于动 物组 织本 身存 在一些 可 以受光 激发 的物
质 ， 肝脏 和肌 肉组织 能产 生一 定量 荧光 ， 如 因此 荧光
般 浓 缩 至 ｌ 以 上 的 浓 度 ，再 分 装 成 小 瓶 冻 ％
显微 镜 下荧光 抗 体 的检测 可能会 产 生一些 假象 。而 且荧 光抗 体容 易在 所在 组织 的各 种理 化处 理过 程 中 被淬 灭 ， 而 可能 出现 假 阴性 ， 且标 本不 宜于 长期 从 并 保存 ， 于该 荧光抗 体 的稳定 性 、 对 保存 期等 问题还 在
体用 于检 测鸡 ＩＧ 的特异性 强 、敏感 性 高 ，且 只需 ｇ
值 为 ０ 再 加 入 ０５ 的叠 氮 钠 ， 后 结 合 物 在 ４ ， ． ＃１ 此 ℃ 避光保 存或 分装 后在一 ０ ２ ℃冻存 。
１２５２ 结 果判定 －．＿
用 制备好 的荧 光 抗体 对 鸡 大肠 杆 菌 Ｋ ７ １ ８ ６０ ２ 、
健 康 公 鸡 ２只 （ｋ ２ ｇ左 右 ） 健 康 公 兔 ２只 （ ｋ ， ２ｇ
收 稿 日 期 ：０ １ Ｏ２ ２ ２ １— — ０
作 者 简 介 ： 凤 琴 （９ ６ ）女 ， 族 ， 车 １ ８－ ， 回 大学 本科 ， 理兽 医 师 ， 助
主要 从 事 实验 诊 断 工作 。
当 １ ： 释 时 ， 光 强度 为 “ ＋ ， ４稀 荧 ＋ ” 且此 时无 非特 异 性荧 光 出现 。 因此 ，： 为荧 光抗 体 的染 色效价 。 １ ４作 注 ：＋ ＋ 体发 耀 眼 的黄绿 色荧 光 ；＋ 菌 体呈 明亮 ＋＋ 菌 ＋＋
用 ｐ ９８Ｎ Ｏ 缓 冲液稀 释抗体 为 １ ５ 或 Ｈ ． ａ ＨＣ ～
光 出现 ， 而人和 猪 的大肠 杆菌 呈 阴性 ， 表 明鸡大肠 这 杆菌 Ｋ ７ ２ ６ ０１ ８的荧 光抗 体 具 有 高 度 的 敏 感 性 和特
异性。 ２４ 荧 光 抗 体 的 染 色 效 价 ．
与 鸡 ＩＧ 的方法 相 同。 ｇ
１２５ 染 色及 结 果 判 定 ＿＿
１２５１ ＩＧ 的 荧 光 染 色 ＿．． ｇ
试 剂 ｌ ２滴 ， ～ 出现 砖 红色 即认 为有 Ｎ ４ 在 ） 直至 Ｈ＋ 存 ，
无 ￥ ４或 Ｎ ＋ ０２ － Ｈ４ 出现 为止 。然后 离心 去沉 淀 （ 除杂 去
蛋 白 ） 上 清 液 即 为 粗 提 ＩＧ ， ｇ 。
１２２ Ｉ Ｇ 的 浓 缩 ＿． ｇ
通 过饱 和硫 酸 铵盐 析处理 ，从 高 免血清 中提 取 的 ＩＧ含量 为 ｌ ．ｇ ， ｇ ５３／ 总量 达 １５７ 。 ｌ ６． ｍｇ