一株腐败希瓦氏菌的筛选鉴定及其染料脱色研究

一株腐败希瓦氏菌的筛选鉴定及其染料脱色研究

江莹;桂震;齐杭杭;罗安杰;刘柳;叶铧骏;蔡亚君

【摘要】[目的]研究一株腐败希瓦氏菌对染料的脱色效果.[方法]从印染废水中筛选到一株对偶氮染料活性艳红X-3B和蒽醌染料活性艳蓝KN-R均具有高效降解作用的菌株,对其进行了菌种鉴定,并分析了该菌在不同培养条件下对两种染料的脱色效果.[结果]生理生化鉴定和16S rDNA序列鉴定结果表明,该菌为希瓦氏菌属腐败希瓦氏菌,命名为Sputrefaciens 4H.该菌在pH=8、37℃下静置培养时,对两种染料的脱色效果最好.该菌6h内可将50 mg/L活性艳红X-3B完全降解脱色,在含有活性艳红X-3B的LB平板上可形成水解圈,推测其能产生水解活性艳红X-3B的胞外酶;该菌对50 mg/L活性艳蓝KN-R的脱色率48 h时可达81.84％,且脱色时染料先被细胞吸附沉淀后再随着细胞的生长代谢逐渐降解,其脱色机制还有待研究.[结论]该研究为印染废水的处理提供了理论依据.

【期刊名称】《安徽农业科学》

【年(卷),期】2015(000)023

【总页数】5页(P224-228)

【关键词】腐败希瓦氏菌;活性艳红X-3B;活性艳蓝KN-R;脱色

【作者】江莹;桂震;齐杭杭;罗安杰;刘柳;叶铧骏;蔡亚君

【作者单位】武汉纺织大学环境工程学院,湖北武汉430073;武汉纺织大学环境工程学院,湖北武汉430073;武汉纺织大学环境工程学院,湖北武汉430073;武汉纺织大学环境工程学院,湖北武汉430073;武汉纺织大学环境工程学院,湖北武汉

430073;武汉纺织大学环境工程学院,湖北武汉430073;武汉纺织大学环境工程学院,湖北武汉430073

【正文语种】中文

【中图分类】S181;Q89

纺织印染废水有机污染物含量高、色度深、碱性大、水质变化大，一直是难处理的工业废水之一［1］，对其处理通常是将物理法、化学法和生物法串联在一起进行，首先通过物理、化学方法将大部分的有机污染物和色度去除，再采用生物方法将剩余的污染物和色度处理到可以达标排放的水平。因为生物处理方法成本低而且无二次污染，所以在其中起主导作用。但传统的建立在细菌系统上的生物处理技术对非偶氮染料基本没有脱色效果，偶氮染料可以在厌氧条件下脱色，但是几乎不能在好氧条件下脱色。笔者从印染废水中筛选到一株既可在厌氧条件下、也可在好氧条件下对偶氮染料脱色，同时也能在缺氧条件下对蒽醌染料脱色的细菌菌株，对其进行了菌种鉴定，并对其对偶氮和蒽醌染料的脱色条件进行了初步研究。

1 材料与方法

1．1 菌株来源菌株筛选自某印染厂废水处理厂二沉池活性污泥。

1．2 主要试剂和仪器用于总基因组提取、PCR产物回收和pMD 18-T载体连接

的试剂盒及大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞均购自Takara公司。主要仪器有紫外分光光度计、美国ABI 9800 PCR仪、美国BioRad DNA电泳系统、美国VITEK32全自动细菌鉴定系统。

1．3 高效降解菌的分离及鉴定将印染废水1∶100加入50 ml浓度为50 mg/L

的活性艳蓝KN-R的LB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7．0 ～7．5)中，分别在0、50、100、150、200 r/min 转速下、30 ℃下进

行培养，定期观察培养基中菌体量及溶液颜色变化。将上清颜色明显褪去的培养物按1∶100转接到新鲜的50 ml浓度为50 mg/L的活性艳蓝KN-R的LB培养基中，重新培养，如此富集培养3次后，将上清脱色效果最好的培养液离心分离菌体，并用无菌水洗涤3次，后悬浮于无菌水中，采用10倍系列梯度等比稀释法将其涂布于50 mg/L活性艳蓝KN-R的LB固体培养基上，30℃下培养，将分离得

到的单菌落分别挑至5 ml 50 mg/L活性艳蓝KN-R的LB培养基中培养，观察各自脱色情况，选取效果最好的菌进行平板划线分离纯化。将分离纯化得到的菌株通过美国VITEK32全自动细菌鉴定系统进行生理生化特性鉴定，并提取其总基因组，通过PCR扩增其16S rDNA，扩增得到的PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载

体并转化进大肠杆菌DH5α菌株中，在含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上挑取克隆子酶切验证后送样测序，测得的序列通过Blast获得其种属信息。1．4 高效降解菌对染料的脱色研究将单菌落转接到LB培养基，30℃、150

r/min培养过夜后转接到分别含50 mg/L活性艳红X-3B和50 mg/L活性艳蓝

KN-R的LB培养基中，研究在不同温度、pH、通气量条件下培养时该菌对两种染料的脱色效果。

2 结果与分析

2．1 高效染料降解菌株的分离与鉴定

2．1．1 分离。经过筛选，得到一株对活性艳蓝KN-R染料具有很好脱色作用的

细菌，该菌在初始接种菌体量107～108 CFU/ml、30℃左右静止培养时，在48

h内使50 mg/L以下浓度活性艳蓝KN-R脱色70%左右;而在6 h内即可使50

mg/L以下浓度活性艳红X-3B及多种偶氮染料完全脱色。但对活性艳蓝进行处理时，以染料作为唯一碳源和能源时不能脱色，必须添加其他碳源才能具有脱色效果，且培养液颜色褪去时发现菌体颜色先变蓝后恢复原色;而对活性艳红等偶氮染料进

行处理时，以染料作为唯一碳源和能源时可将染料脱色，且在平板上培养时可观察

到水解圈现象，因此推测该菌可分泌胞外酶降解偶氮染料，而对活性艳蓝则是一种先吸附、后共代谢的脱色机制。

2．1．2 鉴定。

2．1．2．1 形态学结果。该菌在LB平板上培养时，菌落表面湿润、光滑，浅黄色，不透明，边缘整齐，呈凝滴状(图1a)，菌体呈短杆状(图1b)。

图1 菌株4H形态图

2．1．2．2 生理生化鉴定结果。依据VITEK细菌鉴定系统的预处理要求，将4H

菌进行革兰氏染色，发现为阴性;紧接着将菌落做了氧化酶试验，结果呈阳性，属

于非发酵菌。将纯种菌50℃下培养6 h，选择非发酵菌的BAC药敏卡，进行全自动鉴定，鉴定结果见表1，最终鉴定结果显示该菌为希瓦氏菌(Shewanella sp．)。表1 菌株4H生理生化鉴定结果注:“+”表示阳性;“－”表示阴性。反应结果反应结果触酶 + 三氯新－氧化酶 + 葡萄糖氧化－葡萄糖发酵－阳性生长控制+精氨酸－乙酰氨－赖氨酸－七叶树苷(七叶灵)－鸟氨酸 + 植物鸟尿蓝母－阿拉伯糖－尿素－乳糖－枸橼酸盐－丙二酸盐－山梨糖－苯丙氨酸－蔗糖+多粘菌素B －肌醇－乳糖－侧金盏花醇－麦芽糖 + 香豆酸－甘露醇－硫化氢+木糖－ b-半乳糖苷酶－棉子糖－鼠李糖－

2．1．2．3 16S rDNA序列鉴定结果。将该菌的16S rDNA序列提交NCBI数据库，进行BLAST对比发现，该菌与所有希瓦氏菌属(Shewanella)菌株16S rDNA

序列相似性均达90%以上，与腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)多个菌株的16S rDNA序列相似性均达97%(图2)，与其他希瓦氏菌的相似性也均达90%

以上。因此，该菌初步可确定为S．putrefaciens，命名为S．putrefaciens 4H。图2 菌株4H 16S rDNA序列系统发育树注:Shewanella:Shewanella putrefaciens Sh4 strain，GI 480358995;S．putrefaciens:GIII41 strain，GI 480359002;S．algae:GI 459945362;S．decolorationis:GI