葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的高效重组表达及酶学性质研究

葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的高效重组表达及酶学性质研究葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,EC 1.1.3.4,GOD）是一种黄素依赖型氧化还原酶,它能专一的催化β-D-葡萄糖分解成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。葡萄糖氧化酶在纺织业、畜牧业、食品业、医疗医药业等众多领域均有广泛的应用。

目前食品级葡萄糖氧化酶的工业生产产量不高,发酵副产物比较多,不利于分离纯化,这些问题对食品级葡萄糖氧化酶的发酵生产产生了不利影响。本文选择黑曲霉CBS513.88的葡萄糖氧化酶基因之一goxC,通过密码子优化、信号肽替换对GOD编码区进行改造,提高发酵液酶活;同时以实验室前期构建的低蛋白背景菌黑曲霉SH2和HL1为出发菌株,利用营养缺陷标记pyrG构建葡萄糖氧化酶表达载体系统,进一步提高GOD的分泌表达。

主要结论包含以下几方面:（1）以SH2为宿主的葡萄糖氧化酶重组表达:从NCBI中找到Aspergillus niger CBS513.88中葡萄糖氧化酶相关的4个基因,通过文献查找、BLAST分析及进化树分析选择goxC基因,以SH2为宿主构建GOD重组菌株。通过邻联茴香胺-过氧化氢酶法,测转化子的酶活,发现SH2-goxC5号转化子酶活最高,在第7d时可达563.8 U/mL;50L上罐发酵在179h时酶活为最高,高达1128 U/mL,相比摇瓶提高了2倍多。

（2）以HL1为宿主的葡萄糖氧化酶重组表达:为了探究敲除转录因子prtT 及一系列淀粉酶对黑曲霉发酵培养中营养物质利用的影响,以未敲除prtT基因的HL1作为出发菌来构建葡萄糖氧化酶高效表达重组菌株,筛选出表达量最高的HL1-goxC9号转化子,达到635.1U/mL。同时通过0%⁵%葡萄糖浓度的摇瓶发酵并检测酶活探究葡萄糖浓度对发酵的影响,发现0%葡萄糖浓度的摇瓶在72h时酶活力达到最高为658.3 U/mL,1%葡萄糖浓度的摇瓶在120h时酶活力

达到了599.3 U/mL,发现随着培养基中葡萄糖浓度的提高,达到最高酶活的小时数也随之延长。

（3）葡萄糖氧化酶酶学性质研究:通过亲和层析纯化葡萄糖氧化酶,并通过SDS-PAGE发现葡萄糖氧化酶分子量大小为80kDa左右,去糖基化后发现其分子量大小降为65kDa左右,说明重组葡萄糖氧化酶含有糖基化修饰。重组葡萄糖氧化酶最适pH为5.5,最适温度为40℃。

同时在10 mmol/L浓度下,Ni⁺、Ca²⁺、

K⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺增加葡萄糖氧化酶的活力;EDTA、Fe³⁺对葡萄糖氧化酶酶活影响很小;SDS 或Na⁺明显降低葡萄糖氧化酶活力。在100 mmol/L浓度下,SDS、Ni⁺、K⁺、Mn²⁺使葡萄糖氧化酶活力增加;EDTA、Na⁺明显降低葡萄糖氧化酶活力;Ca²⁺、

Zn²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺对葡萄糖氧化酶酶活影响很小。