遗传分子标记系列

附：部分仪器的使用
1、移液器 2、离心机 3、PCR仪

明天要做的事
1、移液器 2、Marker 3、配制CTAB和氯仿异戊醇 4、巯基乙醇的mol 5、水浴锅 6、枪头、离心管、吸水纸、记号笔 7、电泳槽等，EB、10 × loading buffer 8、学生做预实验。 9、蒸馏水，洗涤研钵用 10、研钵
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2、 ISSR （Inter-simple Sequence Repeat） 分子标记原理 ISSR标记即简单重复间序列，是Zietkiewicz 等(1994）发展的一种新的分子标记。基因组 中分布有大量的重复序列，根据其分布特征可 分为散在重复序列和串联重复序列，微卫星 （即SSR）是一种高度串联重复序列，重复基 序仅2～6bp，分布于常染色质区，是真核生物 基因组重复序列的主要组成部分，均匀分布于 基因组中，正是基于基因组这种特点才出现了 SSR和ISSR技术。
遗传分子标记系列实验
一、实验目的
1、掌握CTAB法提植物基因组DNA的原理 和方法。 2、通过不同个体基因组遗传分子标记的检 测了解遗传标记多态性的应用意义，掌握 检测技术方法。
二、实验原理
1、CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法， 其原理是：采用机械破碎植物细胞(液氮研磨)，然后加入 CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来， CTAB(Cetyltrimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲 基溴化铵) 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此 复合物在高盐( > 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但 在低盐浓度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合 物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍 溶解于溶液中。再经有机溶剂氯仿－异戊醇抽提除去蛋白 质 、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使 核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用 70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB,最后得到DNA。 加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 也可减少酚类、醌类及丹宁类 物质的影响。 还原型巯基成分如 β-巯基乙醇等一些硫醇类物质,通常可 用于保护DNA 免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等 物质的损害。
四、实验步骤
（一）植物基因组DNA的提取 材料：小麦叶片 操作步骤： 1）将新鲜的小麦叶片经液氮冷冻后充分研 磨，取100mg粉末于灭菌1.5mlEppendorf 管中。 注意：液氮小心低温冻伤。
2）加入480ulCTAB提取缓冲液 （1.3%CTAB,133mmol/LTrisHCl,pH8.0,13mmol/LEDTA,0.93mol/LNaCl, 0.66%PVP3600,0.18mol/Lβ-巯基乙醇）， 及3ulRNase,混匀。 3）65℃温浴1—1.5h,期间不时混合样品， 以充分提取。 4）待样品冷却至室温，加入等体积(480ul) 氯仿/异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀30min— 1h;4 ℃，12000rpm离心15min。 5）将上清液转移至一新的1.5ml离心管中， 重复步骤4）一次。
三、实验器材
PCR仪，恒温水浴锅，电泳仪， 水平电泳槽，离心机，移液器， 旋涡振荡器，TakaRa TaqTM PCR试剂盒。
ISSR 引物根据加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的 序列,由上海英骏生物技术有限公司合成,经初步筛 选,确定UBC856序列为(AC) 8 YA为此次试验的引 物。Y=(C,T),本次合成的引物Y=C。
2、反应条件:PCR仪上进行反应
94℃ 94 ℃ 52 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 5min 30s 30s 2min 7min
35cycles
3、扩增产物的检测: 将PCR 产物在含有溴 化乙锭(EtB r) 染料染色的1.5% 琼脂糖凝胶 中电泳,电泳结束后在凝胶成像系统中照相 保存。
6）吸取上清液至一新的1.5ml离心管中，缓慢加 入0.7倍体积异丙醇，轻轻上下摇晃，直到出现白 色DNA沉淀。12000rpm，离心2min，弃上清， 保留沉淀。 7）加入700ul 70%乙醇，涡旋振荡5s， 12000rpm，离心2min，弃上清。 8）重复步骤7） 9）开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙 醇。 注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、 PCR等）实验。 10）加入适量的TE缓冲液（50ul），待DNA充分 溶解后，测定DNA浓度和质量。经适当稀释后直 接用于PCR反应或储存于-70 ℃冰箱备用。

（二） ISSR分子标记实验 1、ISSR -PCR 反应体系(25ul体系) 基因组DNA 1ul UBC856 (10uM) 1ul dNTPs(2.5mM) 2.5ul 10× PCR buffer (含Mg2+) 2.5ul Taq酶 0.25ul ddH2O 17.75ul 25ul
ISSR分子标记是在 SSR标记基础上发展起来的，其基本原理(示意图如下)在 SSR的5’或 3’端加锚 l～4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧 具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。在SSR的3,端或5,端 锚定1-4个简并碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的 位点才能被靶定，因而避免了SSR在基因组上的滑动大大提高了PCR扩 增的专一性。
ISSR的重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增 产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个 引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段，它在 引物设计上比SSR技术简单得多，不需知道DNA 序列即可用引物进行扩增，又可以揭示比RFLP、 RAPD、SSR更多的多态性。因此，ISSR标记是 一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的 DNA指纹技术。ISSR标记呈孟德尔式遗传，在多 数物种中是显性的，目前己广泛用于植物品种鉴定、 遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生 态学研究中。。本实验采用该技术从DNA分子水 平分析了小麦杂交后不同F2代的遗传多样性
附：基因组DNA质量检测
（1）紫外分光光度法检测浓度。取2 μL DNA原 液，用无菌水稀释50 倍，用紫外分光光度计测其 在260 nm、280 nm 波长处的吸光度OD260、 OD280。计算OD260/OD280值及DNA 浓度，样 品DNA 浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数 ×50/1000。 （2）琼脂糖凝胶电泳检测纯度。制备0.8%的琼 脂糖凝胶（含有溴化乙锭），分别取8 μL DNA和 2 μL6×Loading Buffer 上样缓冲液混合，用 0.5×TBE缓冲液于90 V 电压电泳1 h，用凝胶成 像分析系统检测，拍照。