肿瘤耐药的分子机制探究

第四军医人学博十研究生ｊ！’何论文

三、实验结果

１．差异表达的基因

经过消减杂交和ＰＣＲ，共获得２００多个耐药胃癌细胞中的ｃＤＮＡ片段，限制性内切酶消化检测表明，有８６个ｃＤＮＡ片段长度为ｏ．５—２．ｏｋｂｐ，其中６３个克隆在反向打点杂交中呈阴性信号（Ｆ疃１），证实这些克隆中所舍的ｃＤＮＡ片段在药物敏感胃癌细胞中低表达，而在耐药胃癌细胞中高表达。这６３个屯隆中，４０个来自ｓＧＣ７９０１／ＡＤＲ细胞，２３个来自ｓＧｃ７９０１／ｖｃＲ细日包。

Ｆｉｇ１Ｒｅｖｅｒｓｃｄｏｔｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔ．Ｈｙｂ“ｄｉｚａｔｉｏｎｏｆ旺．３２ＰｄＡＴＰＩａｂｅｌｅｄｃＤＮＡ仔ｏｍＳＧＣ７９０１ｃｅｌ】ｓｔｏ

ａｄｏＣｂＩｏｔｃｏｎｔａｊｎｉｎｇＤＮＡ行ｏｍ８６ｃｌｏｎｃｓ．Ｏｎｌｙｇｅｎｅｓｗ“ｈｈｉ曲ｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｒｕｇｒｃｓｉｓｔａｎｔｃｅｌｌｓｄｏｎ’ＩｓｈｏｗＬ１ｐ．ａ９，ｊ９，ｃＤＮＡ打ｏｍ

第四军医人学博１。研究十。了’他论文

Ｆｉｇ３ＰＴＤ００１ｍＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｃａｎｄｐｒｅ（ｉｌｃｔｅｄａｎｌＩｎｏａｃｉｄｓ，ｌｔａｌｉｃｌｅｔｔｃｒｓｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｓｅｍ卜ｑｕａｌｌ【１ＩａｃＩＶｅＰＣＲ

４．ＰＴＤ００１基因的原核表达

构建好的ＰＱＥ．３２．ＰＴＤ００１载体经酶切，出现约８００ｂｐ大小的片段，与全长ＰＴＤ００１ｃＤＮＡ长度相符（１・ｉｇ．４）。ＰＴＤ００１ｎ１ＲＮＡ编码的蛋白质由２１８个氨基酸残基组成，用ＰｒｏｔＰａｒａｍｔｏｏｌ（ｗ１Ｉ¨ＰⅢ６，一＾ｇ，比，６９，譬如）程序计算其分子量为２５ｋＤａ。ＩＰＴＧ诱导后，ｐ０Ｅ一３２一ＰＴＤ００１转化的Ｍ１５菌裂解液中新出现一条约２５ｌ（Ｄａ的蛋白带（１一’喀５），薄层扫描分析表明该蛋白约占菌体蛋白总量的４９２５％（Ｆｋ６）。

Ｆｉｇ．４Ｅｎｚ”ｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｎｃａｌｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｌｌａｎｔｐＱＥ—ＰＴＤ００１（ＤＨ５ａ）

１ａｎｅｌ，ｐＱＥ—ＪＤ皿００，／ＳａｃＩ÷ＢａｍＨＩ；

１ａｎｅ２，ｐＱＥ—Ｐ丁Ｄ∞，（ＤＨ５ａ）；

１ａｎｅ３．１ｋｂＤＮＡｍａｒｋｅｒ

第四军医大学博上研究生学位论文

２５ｋＤ

Ｆｉｇ．５．ＡｎａｌＶｓｉｓｏｆｉ１１ｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓＩｕｎｐｒｏｕｕｃ【ｓｌｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｃｓ．ＴｈｅｎｌｏｃｋｖｅｃｔｏｒｏｒｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＭ１５ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｂｖ１ｎ１Ｍ工ＰＴＧｒｅｓｐｅｃｔｉＶｅｌｙｆｏｒ４ｈ，ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓｗｅｒｅａｐｐＩｉｅｄｔｏ１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，ｆ０１ｌｏｗｅｄｂｙ

ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｎＩＩｉａｎｔｂｌｕｅＲ２５０ｓｔａｌｎｉｎｚＬａｎｅｌ，ｃｅｌｌＩｖｓａｔｅｓ仟ｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｔｒａｎｓｆｏｍｅｄｐｌａｓｍｉｄｔｒａｎｓｒｏｍｌｅｄＭ１５ｃｅｌＪｓ；Ｉａｎｃ２，ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓｆ如ｍｎｌｏｃｋｖｅｃｔｏｒ

Ｍ１５ｃｅｌｌｓ：１ａ１１ｅ３．１０ｋＤＤｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ

Ｆｌｇ．６Ｔｈｉｎ－１ａｙｅｒｓｃａｎｎｉｎｇａ１１ａＩｙｓｉｓｏｆＳＤＳ—ＰＡＧＥｇｅｌ，ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｐｅａｋ

ｒｅｐｒｅｓｅｎＬｉｎｇｔｈｅｔａ唱ｃｔｐｒｏｔｅｊｌｌ，ａｃｃ叭ｍ｛ｉｎｇｆｏｒ４９２５％ｏｆｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ．

后几乎没有存活细胞。ＤＮＡＬａｄｄｅｒ实验中梯状ＤＮＡ的出现雎及免疫印迹检测到ＰＡＲＰ裂解严物均证实阿霉素诱导Ｈ５２２发生凋亡（Ｆ唔１）。

Ｃｎ５１２讯咖

ＡＢＣ

Ｆｉｇ．１ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈｂｙｄｏｘｏｎｌｂｉｃｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎＨ５８１０ｃｅｌｌｓ．Ｈ５８１０ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎ２ｅｄｗｉ【ｈｅｓｃａｌａｔｉｎｇｄｏｓｅｓｏｆｄ。ｘｏｎＩｂｉｃｉｎ（Ｏ．５，ｌ，２，５｝Ｍ）ｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ．ｗｈｅｎｃｅｌｌｓｗｅｒｅｎｏｔｔｒｅａｔｅｄ，ｖｅｈｉｃｌｅａｌｏｎｅ（ｅｑｕａｌＶ０１ｕｍｅｏｆｗａｔｅｒ）ｗａｓａｄｄｅｄ

Ａ．ＣｅｌｌｖｉａｂｉｌｊｔＹ（Ａ５６０一６５０）ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙａｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒａｆｆｃｒｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＭＴＴｓ０１ｕｔｉｏｎｉｎ９６一ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ．ＴｈｅｅＸｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｒｅｐｅａｔｅｄａｔｌｅａｓｔｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ，ａｎｄｄａｔａｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｔｈｅｍｅａｌｌ士ＳＥ．

Ｂ，Ｃ、，ｔｏｐｌａｓｍｉｃＤＮＡｓｗｅｒｅｉｓ０１ａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅＩｅｌｅｃｔｒｏ口ｈｏｒｅｓｉｓａｓｄｃｓｃｒｉｂｅｄｉｎ”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，’’ＥｑｕａｌａｍｏｕｎｔｏｆＤＮＡｗａｓｌｏａｄｅｄｉｎｅａｃｈｌａｎｅ．Ｍ，１．ｋｂＤＮＡｍａｒｋｅｒｆｒｏｍｌｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩｒＬｃ．Ｃ，ＰＡＲＰｃｌｅａｖａｇｅｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙ、ｖｅｓｔｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇｗｉｍａｎａｎｔｉ．ＰＡＲＰａｎｌｉｂｏｄｙ，ｗｈ记ｈｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔａｃｔ（１１６ｋＤ曲ａｎｄｃｌｅａｖｅｄ（８５ｋＤａ）ｐｒｏｄｕｃｔｓ．

４

Ⅲ‘ａ

第四军区人学博士研究生学位论文

２．阿霉素诱导ＡＫＴ以及ＭＡＰｌ（ｓ独特的活化动力学

我们分析了阿霉素对ＡＫＴ以及ＭＡＰＫｓ（Ｅｒｋｌ／２、ｐ３８、ＪＮＫ）磷酸化的影响，ＡＫＴ在药物暴露３０ｍｉｎ时磷酸化水平显著增加，包括丝氨酸４７３和苏氨酸３０８两个位点，８ｈ后磷酸化水平降低，１６ｈ后逐渐回复到基础水平。相比之下，三种ＭＡＰＫｓ磷酸化的诱导延迟发生，在药物暴露后４ｈ观察到，但持续存在于整个药物刺激过程中，ＭＡＰＫｓ磷酸化在２４ｈ时的降低可能是细胞死亡导致的，因为超过５０％的细胞在药物处理２４ｈ后死亡。以上结果显示ＡＫＴ以及Ｍ人ＰＫｓ信号转导途径均可被阿霉素诱导活化，但其机制可能互不相同。

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