分离分析原版

酰胺型二氧化硅纳米粒子的制备及其在毛细管电泳电色谱分离带电化合物和中性化合物中的应用
摘要：一种新颖的两亲性二氧化硅纳米粒子成功制备，其表面键合了辛酰基氨丙基，粒径在0-250nm之间，我们通过元素分析，傅里叶红外变换光谱表征其特征。

这种酰胺型二氧化硅纳米粒子可以作为伪固定相用在毛细管电色谱中分离芳香族酸，碱和中性化合物。

五种芳香酸在最佳实验条件下电渗流驱动下向同一方向迁移，并得到高效分离。

运行缓冲液由40%甲醇，10mM pH值为5.5的磷酸盐缓冲液，1.0mg/mL酰胺型纳二氧化硅米粒子（OA-NPs）构成。

在这种缓冲液运行下，碱性化合物得到基线分离，且峰型相对对称。

由于极性酰胺基存在OA-NPs表面，发生在带电荷的碱性分析物和毛细管柱上的硅醇间的硅羟基解离效应必然受到抑制。

因而，这种新合成的功能化的二氧化硅纳米粒子能用来分离中性化合物，且分离效果很好。

关键词：毛细管电泳电色谱，纳米粒子，制备，伪固定相
1引言
纳米粒子作为化学中最吸引人前沿物质由于其适用性，新颖性和多样性已广泛应用到很多领域。

在过去十年，纳米粒子由于其在催化，生物模型设计，生物标记，传感，光学和光电学中的广泛应用得到活跃研究。

就纳米粒子在分离科学中的应用，其特殊兴趣集中于作为伪固定相在毛细管电色谱中的应用。

具有大表面积的固定相与电渗流系统相结合具有高效分离的潜能。

应用于毛细管电色谱中的纳米粒子主要包括聚合物纳米粒子，金纳米粒子，分子印迹聚合物纳米粒子，聚合物，二氧化硅纳米粒子等。

我们知道，1989年瓦林福德和尤因最先把纳米粒子应用到毛细管电色谱中。

他们用磺化的聚合物纳米粒子分离了五种磺化的邻苯二芬胺。

Neiman等人制备了中性和两亲性的有机物修饰的硅溶胶并用他们分离芳香酸和它们的同分异构体。

另外两个人用化学的方法修饰了二氧化硅纳米粒子，其粒径大约为500nm，并用这种纳米粒子分离了多环芳烃和萘的衍生物。

外面涂覆聚乙二醇的聚苯乙烯乳液纳米粒子可以用来分离DNA。

功能化的二氧化硅纳米粒子可以用多种方法制备，如化学气相沉积法，电喷射法，微乳液法。

例如，Bagwe等人报导的二氧化硅纳米粒子油包水的微乳液法制备，然后通过四乙氧基硅烷与各种有机硅烷共水解进行表面修饰。

最近几年带有不同官能团的纳米粒子如带有羧基，氨基，磷酸酯，聚乙二醇，十八基的纳米粒子已成功合成。

最近，我们制备了一种新颖的两亲性二氧化硅纳米粒子，其表面键合了辛酰基和氨丙基，并用它分离不同的化合物。

在这篇文章中我们延伸了合成功能化纳米粒子的合成策略。

用一个很相似的方法，合成了粒径为250nm拥有两亲性的酰胺基嵌入疏水性的烃基表面的
二氧化硅纳米粒子。

当把它用作毛细管电色谱中的伪固定相，获得了独特运行缓冲溶液pH 对电渗流的影响曲线图。

当运行缓冲溶液的pH较低时，五种芳香酸迁移方向与电渗流方向一致，在八分钟内实现基线分离。

很强的基础化合物在传统的毛细管区带电泳模式下不能实现基线分离并获得相对匀称的峰型，因为动态吸附涂料的存在能减弱分析物与毛细管内壁残留的硅羟基的相互作用。

因而，两亲性二氧化硅纳米粒子能用来分离某些中性溶质，并提高其分离度。

2材料和方法
2.1化学药品和试剂
对甲基苯磺酸，对氨基苯磺酸，水杨酸，苯甲酸，对硝基苯甲酸，苯胺，吡啶，硫脲，邻苯二甲酸二甲脂，邻苯二甲酸二乙酯，邻苯二甲酸二丁酯等均从天津科威化工公司购买（中国天津）。

甲醇，磷酸，氢氧化钠，磷酸二氢钠，乙腈，盐酸等购买于天津康科德公司（中国天津）。

氨丙基三乙氧基硅烷（99%）购买于天津国泰华荣化工新材料有限公司（中国江苏，张家巷）。

氨丙基修饰的二氧化硅纳米粒子由陈海明硕士用电喷射的方法制备（天津大学药学院）。

所有试验使用双重去离子水。

把一定量的磷酸二氢钠溶解在双重蒸馏水中，然后用0.1mol/L的氢氧化钠或1.0 mol/L 的磷酸调节到大约pH。

所有溶液使用前均用0.45μm的尼龙布过滤并用超声波清洗器脱气。

石英玻璃毛细管规格75μm i.d ×375μm o.d（中国河北，河北永年锐沣色谱器件有限公司）。

在使用之前分别用甲醇，双重蒸馏水，1M氢氧化钠，双重蒸馏水，0.1M盐酸，双重蒸馏水和运行缓冲溶液冲洗半小时。

2.2仪器
所有毛细管电色谱试验均在TH-300高效液相-毛细管电泳仪（中国，河北，保定天惠仪器）上进行。

一个KH-50B超声波清洗仪（江西，昆山禾创仪器有限公司）用来混合缓冲液。

XL30型扫描电镜（Phililps公司，Netherland）和G2 F20型透射电镜用来研究纳米粒子的形态和尺寸。

傅里叶变换变换红外光谱4000-400cm-1（FTIR，Magna-560红外光谱仪，Nicolet，美国）分析来表征纳米粒子的化学结构。

元素分析仪（Tucson，AZ，USA）用来表征纳米粒子C，H，N含量。

电渗流用硫脲作为中性标记物，紫外检测波长为214nm。

2.3功能化二氧化硅纳米粒子的制备
向一个三颈圆底烧瓶中加入0.25g氨丙基化的硅球，30mL干燥的甲苯，和
0.5mL吡啶。

用氮气吹走空气并搅拌，然后逐滴加入1.0mL辛酰氯。

于110°C下搅拌回流8小时。

过滤得到形成的纳米球，依次用笨，甲醇，水，甲醇洗数次，在80°C下真空干燥过夜。

制备过程如图1A。

3结果与讨论
3.1纳米粒子的表征
图1B和C分别是所制备的纳米粒子的扫描电镜和透射电镜图，从图我们可以观察到表面改性过的纳米粒子是单分散的，且圆整度优异。

我们选择50个粒子每个测三次得半径范围为250 nm,误差范围在12nm。

氨基纳米粒子和酰胺基纳米粒子的元素分析结果如表 1.从表中数据我们可以计算出酰胺基纳米粒子的表面酰胺基团的含量为0.45mmol/g。

图1D显示的是纯净的二氧化硅纳米粒子（Ⅰ）和酰胺型二氧化硅纳米粒子（Ⅱ）的傅里叶红外谱图。

酰胺型纳米粒子与未修饰的纳米粒子相比红外谱图上出现了几个宽的吸收峰。

2960.0-2850.0处的吸收峰分别是C-H的不对称伸缩振动和对称伸缩振动。

波长在1502.0和1350-1200范围内的峰分别是酰胺基中N-H，C-N的弯曲振动，谱带Ⅲ是酰基中C-N的弯曲振动。

3.2电渗流
电动驱动分离系统，运行缓冲溶液的pH值对电渗流的影响很大。

我们用2-8不同pH 值的运行缓冲溶液考察pH值对电渗流的影响，运行缓冲溶液有40%的甲醇，10mM的磷酸盐缓冲液，1.0mg/mL的酰胺型二氧化硅纳米粒子构成。

图2是运行缓冲溶液的pH值对电渗流的影响，其中负的电渗流代表阳极的电渗流，负的电渗流代表阴极的电渗流。

如图2B 所示，这个分离系统既可以产生阳极电渗流也可以产生阴极电渗流。

从pH值在2-8范围内变化时，电渗流在-1.32 ×10-4cm2v-1s-1-3.53×10-4cm2v-1s-1变化，这与传统的毛细管电泳系统不同。

这样，通过改变运行缓冲溶液的pH值可以很容易控制电渗流。

我们知道，电渗流的大小和方向取决于毛细管壁的电荷密度和电势。

在较低的pH条件下，吸附在毛细管内壁的OA-NPs酰胺基团解离带正电荷，由此获得了反向的电渗流。

用不含OA-NPs的缓冲溶液冲洗毛细管柱2-3小时，我们观察到中性分析物仍向阳极迁移，说明我们的猜想是正确的。

酰胺基是非常弱的碱，在低pH值的电渗流下，酰胺基水解产生的氨基和未反应完的氨丙基三乙氧基硅烷中的氨基很少存在于OA-NPs表面。

pH值升高，酰胺基的离解在一定成程度上受到抑制，而此时硅羟基的解离程度增大，从而电渗流发生了反转，
由阳极流到阴极。

3.3分离芳香酸
目前，很少报导用毛细管电泳分离有计算性化合物的，但胶束电动色谱却频繁用到，尽管碱性缓冲溶液下毛细管区带电泳也可以用来分离某些酸性化合物。

为了快速高效的分离，分析物的迁移方向与电渗流的方向相同是非常有利的。

在运行缓冲液中加入OA-NPs，pH值较低时，电渗流从阴极到阳极，在这种条件下，酸性物质得到了快速分离。

图3A是在最佳实验条件下五种酸分离的电色谱图，所有酸性物质在8分钟内实现基线分离。

在相同缓冲液中不加入纳米粒子时，分离一小时，仍未出现色谱峰，因为阴极电渗流非常弱。

用这个体系分离带电物质时，分离机理更复杂。

离子交换，疏水性，电泳淌度都可能会影响分离效果。

图3B是pH值对有机酸分离的影响。

随着pH增大，由于OA-NPs失去电荷，分离时间延长，峰变宽，分离效率降低。

图3C表明甲醇含量对分离效果的影响。

当甲醇含量低于40%时，纳米粒子不能完全溶解在缓冲溶液中，分散性不好。

实验发现，随着甲醇含量的升高，电渗流不断降低，分离时间延长。

因而实验选择甲醇含量为40%作为最佳实验条件。

我们还研究了分离电压的影响。

随着分离电压的升高，分离速度相应加快。

当电压高于-21KV时，会形成大气泡，使电流中断，故选择-21KV作为最佳分离电压。

在最佳的实验条件下，我们对五种酸的保留时间，峰面积，峰高做了六次平行实验，已验证此实验的重现性。

各种样品的保留时间的标准偏差范围为1-3%，峰面积和峰高的标准偏差范围为3-7%。

这说明了这种方法的重现性较好，能用来定量分析。

3.4分离碱性化合物
在传统的毛细管区带电泳co-EOF模式下不能分离碱性化合物。

因为碱性化合物所带的部分正电荷与毛细管内表面所带的负电荷相互作用，导致严重的峰拖尾。

图4是分离邻甲苯胺，苯胺和吡啶三种碱性分析物的色谱图，曲线A没有加入纳米粒子，曲线B加入了纳米粒子。

从图4B我们可以看出，在运行缓冲溶液中加入OA-NPs时，增加了迁移时间窗，使得碱性物质得到较好的分离。

好的峰型可能是由于纳米粒子解离的带正电酰胺基团缓解了带正电的碱性化合物与带负电的毛细管内壁之间的吸附作用。

3.5分离中性化合物
目前，很少有文章报导用二氧化硅纳米粒子或聚合物纳米粒子分离中性化合物的。

鉴于带有相同官能团的中性化合物在整体住上能高效分离，我们尝试加入OA-NPs分离了一些典型的中性化合物。

图5是分离硫脲，甲苯，萘三种中性芳香物的色谱图。

图中洗脱顺序表明是反相色谱行为。

我们还尝试分离其他的中性化合物，最初并未观察到分离，可能是由于
加入高剂量的有机改性剂使中性物不能溶解其中。

我们最终选择了水溶性的表面改性剂（CATB）加入缓冲溶液中。

CATB可以增加纳米粒子的悬浮的稳定性，即便是在临界胶束浓度。

进而提高了纳米粒子的溶解性。

图6是分离几种二烃基邻苯二甲酸盐的色谱图，其中曲线A代表缓冲溶液中没有加入纳米粒子，曲线B在缓冲溶液中加入纳米粒子。

因而，在运行缓冲溶液中加入纳米粒子不仅提高了分离度而且提高了分离柱效。

为了进一步精确证明机理，我们将继续做此工作。

4结论
在这项研究中，我们成功制备了内嵌极性官能团辛基-酰胺基团纳米粒子，并将此纳米粒子作为毛细管电泳缓冲溶液的添加剂，分离了不同种类的化合物。

用酸性缓冲溶液在co-EOF条件下高效快速分离了五种芳香酸。

我们研究的几种碱性化合物也得到较好分离，峰型对称，可能是由于涂层的动态吸附抑制了带正电的碱性化合物与带负电的毛细管内壁之间的相互作用。

当纳米粒子加入到水溶性的运行缓冲溶液时，中性分析物得到较好的分离。

实验结果证明了OA-NPs的有用性和多功能性。

然而，为了使纳米粒子在运行缓冲溶液中充分溶解得到稳定的悬浮液，很多情况下要加入有机改性剂，这将限制其在某些领域的应用，比如蛋白质的分离。

为了克服此缺陷，我们实验室将合成亲水性更强的二氧化硅纳米粒子。