9 糖化酶活力测定

标定：
（p38）准确称取基准物K2Cr2 O7 0.05g，置500 mL容量瓶中，加 水25 mL溶解，加1g KI 和 10mL c（1/2H2SO4）= 2mol/L 硫酸溶液， KI溶解后，暗处静置10min，加水150mL，用配好的硫代硫酸钠溶液 滴定，加3mL 0.2%淀粉指示剂，滴定到溶液又蓝色变为亮绿色为终 点，体积V1mL。同时做空白试验，体积V2 mL。
碘量法反应（淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄 糖具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧 化）：
I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O
NaIO（过量）+ CH2OH(CHOH)4CHO CH2OH(CHOH)4COOH +
NaI
过量的NaIO酸化后析出碘（I2），用硫代硫酸钠标 准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。 I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI
注意事项
酶液制备时，酶液浓度最好控制在消耗 0.05mol/L硫代硫酸钠（空白和样品）的 差数为3~6ml左右(以每毫升约50~90单位 为宜)。 配制碘液时碘先和碘化钾溶解，溶解完全 后再稀释。

二、仪器和试剂
1.仪器 具塞比色管、碱式滴定管、恒温水浴 锅、分析天平、电子秒表、酸度计。

2.试剂 （1）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液
称取醋酸钠(CH3COONa· 3H2O)2.8g，用蒸馏水溶解， 定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)2.9mL，定容至 1000mL。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液 以酸度计或精密试纸校正pH。
式中 V0——空白所消耗硫代硫酸钠体积（mL）； V——样品所消耗硫代硫酸钠体积（mL）； C——硫代硫酸钠实际浓度（mol/L）； 90.05 ——1mL 硫代硫酸钠标准滴定溶液所相当的葡萄糖质量（mg）； 2 ——吸取酶液2mL； 32.2——反应液总体积（mL） 5 ——吸取反应液样品的体积（mL）； n ——酶液稀释倍数。
其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之 间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。
四、计算
糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1 毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。
酶活力单位（U/mL或U/g）= （V0-V) × C×90.05 ×（32.2/5）×（1/2）×n ×2
计算：
C（Na2S2O3Baidu Nhomakorabea=
m（基准物质量，g）
（V1-V2）×0.04903 0.04903：与1mL Na2S2O3标准溶液相当的中铬酸钾的质量，g。
（3）C(1/2 I2)=0.1mol/L标准滴定碘液 配制：称取碘化钾36g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至 1000ml贮存于
棕色瓶中。 标定： 已经标定的C（Na2S2O3）=0.05mol/L 硫代硫酸钠标准滴定至蓝色消 失，淀粉做指示剂。 计算：p39
（2） C（Na2S2O3）=0.05mol/L 硫代硫酸钠标准滴定溶液
配制：
称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3· 5H2O)13g和碳酸钠0.1g（硫代硫酸 钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2）， 定容至1000mL，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封 保存，配制后应放置一星期标定使用。
目的
学习糖化型淀粉酶（或液体曲酶）活力的 测定方法 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的 指导意义
一、原 理
α-1，4-糖化酶：催化淀粉水解，从淀粉分子非还 原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖， 反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖 化性淀粉酶的活力。还能缓慢水解α-1，6-葡萄糖 苷键，生成葡萄糖。 酶活力单位：1mL液体酶（或1g固体酶）在40度、 PH4.6条件下，1h降解可溶性淀粉每产生1mg葡 萄糖，即为一个酶活力单位。 在用Na2S2O3硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶 活力。
称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸 的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。
三、测定方法
1． 待测酶液的制备
a.液体剂型糖化酶 取1mL液体酶液，用pH4.6醋酸钠缓冲溶液将其 稀释定容至500mL，待测。
b. 固体剂型糖化酶 称取1-2g待测酶，用pH4.6醋酸钠缓冲溶液将其 溶解、稀释、定容至500mL，3000r/min离心 10min，上清液待测。
2．酶活力的测定 （1）向A、B（空白）两支具塞比色管中，分别 加入2%可溶性淀粉溶液25mL及 pH4.6的乙酸钠 缓冲液5mL，摇匀，在40℃的恒温水浴中预热 5min； （2）在A管中加入待测酶液2mL，摇匀，在此温 度下准确反应30min，立即向A、B管中各加 20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应，摇匀，迅速 冷却； （3）立即向B管中加2mL待测酶液，摇匀，作空 白对照。
第九章 糖化酶活力的测定
概述
糖化型淀粉酶（一类酶）：将淀粉水解成麦芽 糖或葡萄糖，包括以下几种：
淀粉 β-淀粉酶： 淀粉-β-1，4-麦芽糖苷酶 淀粉
糖化酶： 淀粉-α-1，4-葡萄糖糖苷酶
麦芽糖
淀粉 异淀粉酶： 淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（真菌淀粉酶） 麦芽糖
葡萄糖
概述
糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵 提炼而成。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非 还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢 水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。 本产品广泛用： 生产白酒、黄酒、酒精、啤酒；用于以葡萄糖作发 酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵； 生产各种规格的葡萄糖。 总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都 可适用。
（4）0.1mo1/L氢氧化钠溶液 （5）20%氢氧化钠溶液
称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。
（6） c（1/2H2SO4）= 2mol/L 硫酸溶液 （7）0.5%淀粉指示剂 （8）2%（20g/L）可溶性淀粉
量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。
（4）分别取上述反应液与空白液各5mL，放入 250mL碘量瓶中，准确加入C(1/2 I2)=0.1mol/L标 准碘液10mL，再加入0.1mol/L氢氧化钠15mL，摇 匀，暗处放反应15min。 （5）取出，加入c（1/2H2SO4）= 2mol/L 硫酸溶液 2mL，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时， 加入几滴0.5%淀粉指示剂，继续滴定至无色为终 点。