蛋白质分析鉴定

怎样才能确定蛋白质分子的一级结构 呢？测定蛋白质的一级结构，就是要 确定蛋白质多肽链中氨基酸残基的排 列顺序，其基本战略是由Sanger开创 的肽链端基分析法与不同切点的肽片 段拼对法的巧妙结合。
确定蛋白质分子的一级结构，一般需 要经过以下步骤：
1. 纯化待测的蛋白质分子，测定其分 子量并确定分子中多肽链的数目。 对于由两条及两条以上多肽链组成 的蛋白质分子，则需将其拆开（断 裂二硫键）并单独分离出来。
蛋白质的等离子点（特征常数）： 指在纯水中（即没有其它盐类存在） 蛋白质的正离子数等于负离子数的 pH 值 。因蛋白质的等电点不是一成不变的，它 随溶剂性质、离子强变等因素而改变。
二、蛋白质分子的大小
相对分子质量 Mr 从一万到几百万或更 大，对Mr的测定，按性质分两类： 1.根据化学组成测定最低相对分子量
样品的溶解
是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。
溶解的目标： 1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体 完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则 样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出 现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强 度会下降）； 2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、 脂类、多糖和核酸等物质的去除； 3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解 状态。
三、 蛋白体的胶体性质
胶体：指质点大小在1nm-100nm范围内所构成 的分散系统 蛋白分子直径 2nm-20nm，其溶液是胶溶液并 且其分子表面分布有亲水氨基酸的极性R基，是一种 亲水胶体，具有亲水胶体的性质： 1、 具有半通透性 2、丁达尔效应 3、布朗运动 等 。
蛋白质相对分子质量大，在溶液中形成 的颗粒大，不能通过半透膜。
3、米伦反应(Millon Reaction) 蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸 汞及硝酸的混和液)，蛋白质首先沉淀，加热 则变为红色沉淀，此为酪氨酸的酚核所特有 的反应，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦 反应。
第二节 蛋白质分析技术
氨基酸序列分析
电泳技术 空间结构分析
生物质谱技术
多肽链中氨基酸序列分析
双向电泳的分类
非变性 2D-PAGE：两向均在非变性条件下 进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观 分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是 一样的 非变性 /SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性 IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也 在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价 键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。
透析：利用蛋白质不能通过半透膜的性 质将其与小分子物质分开的分离方法
四、蛋白质的沉淀作用
蛋白质保持稳定的亲水胶体状态，这 种稳定性主要由两因素决定： 1、 水化作用 存在有极性R基（—NH2、—COOH、 —OH等），故蛋白质分子表面结合有一层 水分子，称为水化膜，其可防止分子互碰 而聚集。
2 、电荷排斥作用 蛋白质是两性分子，一定 pH 值下，分子 带相同电荷，同性电荷互斥，使分子不能聚 集。 由此，改变稳定性的条件，蛋白质的稳 定性被破坏，从溶液中沉淀出来： a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。
4. 将多肽链裂解为小肽段。 采用专一的化学法或蛋白酶水解 法可在特定的位点将大分子的多肽 链部分降解为小肽段，再采用适当 的分离方法，将这些小肽段分别分 离开来。
5. 肽片段的氨基酸顺序分析。
采用Edman降解法，分别分析测定各肽片 段的氨基酸排列顺序。该法用异硫氰酸苯酯 标记N-末端氨基酸残基，然后将其水解并分 离出来加以鉴定，剩余的肽片段回收后再进 行下一个残基的分析测定。如此循环操作， 就可以将一条肽片段的全部氨基酸顺序排列 出来。
起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表 面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在 盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否 则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的 少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时， 两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过 高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验 的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时， 也应使两性电解质的pH值与之相符合。
二维SDS-PAGE
同普通SDS-PAGE类似。 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶， 因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到 浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低 浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
凝胶的图像处理分析和典型流程
凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立：
双向电泳： 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究 中分离复杂蛋白质混合物的首选技 术。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可 重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修 饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而 保证待研究蛋白的可检测性。
2. 分析多肽链的氨基酸组成。
将多肽链用酸或酶完全水解，再用离子交换树脂 （或用高效液相色谱）将各种氨基酸分离开，测 定其含量并计算各种氨基酸组成的百分比。下图 表示蛋白质的水解产物通过Moor-Stein Dowex 50 离子交换柱层析的自动分析结果。
3. 端基分析
分析确定多肽链的 N-末端和 C-末端氨基 酸残基，作为整条多肽链的标志点。 N末端测定多用二硝基氟苯法和丹磺酰氯 法， C- 末端的测定可用肼解法和羧肽酶 法 。
电泳技术
纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) (可分为圆盘电泳和垂直平板电泳） 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦(IEF) 双向电泳 毛细管电泳
在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动 的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)， 蛋白质的分子量、分子形状以及与介质的摩擦系数(f)。
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基 团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、 OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还 原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷 的三丁基膦（TBP）进行还原。
等电点pI
指某一 pH值时，蛋白质所带正负电荷恰好相等 ，净电荷为0，此时溶液的pH值称为等电点。 蛋白质分子所带电荷的性质和数量由蛋白质分 子中可解离基团的种类和数目、溶液pH值所决定。 pH大于pI，蛋白质带负荷，电场中向阳极移动 pH=pI，电场中不移动，蛋白质沉淀出，此时导 电率、渗透压、粘度等均达最低值。 pH小于pI， 蛋白质分子带正电荷，电场向阴极 移动。
六、蛋白质的颜色反应
可作为蛋白质定性定量测定的依据
1、茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) α－氨基酸和水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)功 能时，产生蓝色反应，由于蛋白质是由许多 α－氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。
2、双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中和硫酸铜功能呈现紫红 色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上 －CO－NH－键的化合物都呈此反应，蛋白 质分子中氨基酸是以肽键相连，因此，所有 蛋白质都能和双缩脲试剂发生反应。
五、蛋白质的变性作用
天然蛋白质受到理化因素的影响， 氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭 到破坏，分子内部结构发生改变，致使 生物学 性质、理化性质改变的现象。
物理因素： 加热、紫外线、X—射线、超声波 化学因素： 强酸、强碱、尿素、乙醇、三氯醋酸等
蛋白质变性后，结构虽有改变，但组成 成分和Mr没有改变
毛细管电泳 capillary electrophoresis
毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分析离子在电场作用下移动 的速率不同而达到分离的目的，这种 技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液 中能离解为离子的物质。
以毛细管为分离通道，高压直流电 场为驱动力的新型液相分析技术。 可将有生物化学意义的复杂化合物 在不改变其性质的前提下进行分离
一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）：
IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CHCO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R 包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10 不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将 适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合， 在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯 酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的 IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳 定的IEF分离达到真正的平衡状态。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用聚丙烯酰胺 凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶是由单 体丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的多 孔网状凝胶。
不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品胶。 PAGE分辨率很高。
电泳过程
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳法 SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型 表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中 的氨基酸残基按大约1 1.4比例结合。 每一个蛋白质分子都因为结合了许多的 SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分 子原有的电荷则可以忽略。该法主要利 用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白 质。 用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以 估算出不同蛋白质的分子量。
IPG IEF 中pH梯度的选择
常用方法：先宽后窄，先线性后非线 性，先短后长，预试验确定。
百度文库
两维间的平衡
一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存 在两片塑料膜间于－80°保存数月。 但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以 便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而 在SDS-PAGE是电泳能顺利进行。
第六章 蛋白质的分析和鉴定技术
第一节 蛋白质的物理化学性质分析
蛋白质由氨基酸构成，具有氨基酸 的一些功能基团，保留了一些氨基酸的 性质，但又发生了质的变化，具备一些 氨基酸没有的性质。
一、 蛋白质的两性解离和等电点
两性解离：蛋白质是两性电解质，解离情况 比氨基酸复杂得多。
在特定的pH值范围内，蛋白质解离产生带正 电荷或负电荷的基团，分折蛋白质的滴定曲 线可得到各解离基团的PK′值
利用化学分析定量测定蛋白质中某 一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子 中含1个这种元素，
2. 用物理化学方法来测定蛋白质的相对 分子质量 是目前常用的方法，包括测定质点 的：扩散系数、沉降超离心、凝胶过滤 、渗透压等。 渗透压测定法最为方便，但准确度 较差，超离心法最为准确，但需昂贵的 超速离心机，
非变性 / 还原 /SDS-2D-PAGE：非变性条件下 IEF 聚焦， 之后用 8M 尿素＋ 5% β-ME＋2%SDS 进行平衡，再 进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可 进行点的切取、蛋白酶消化、 MALDI-TOF-MS 分 析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。
变性 2D-PAGE：样品先用 2%SDS＋5%β-ME＋95℃ 变性 5min，IEF 在 8M 尿素＋ 1%NP-40 条件下进行， 之 后 胶 条 用 2 % SDS＋5%β-ME 平 衡 ， 然 后 进 行 SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分 析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起 的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于 100Kd 的蛋白质点少于第三种方式