医学免疫学实验

3. 酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为PH6~8。
（一）凝集反应
定义：是颗粒性Ag（如完整的细菌、细 胞）与相应 Ab，在适当条件下，出现肉眼可见的凝集物现象。 方法：直接凝集（玻片凝集、试管凝集）
间接凝集
1、直接凝集
①玻片凝集：定性实验，已知Ab测未知Ag
用于细菌和血型鉴定 玻片凝集反应是在玻片上将抗体直接与颗粒 性抗原物质（如细菌、红细胞等）混合，在有适 当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异 性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如 两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
血清(mL)
抗原(mL) 稀释度 结果
0.5
0.5
0.5
0.5 1.0 1:40 +++
0.5
0.5 1.0 1:80 ++
0.5
0.5 1.0 1:160 ++
0.5
0.5 1.0 1:320 +
0.5
0.5 1.0 1:640 -
弃0
0.5 1.0 盐水对照 -
终体积(mL) 1.0
1:20 ++++
而提高了试验的敏感性(提高10~20倍)，并缩短 了反应时间（与双向琼脂扩散相比）。同双扩， 可定性确定抗原含量。
电场力
电渗力
Ab Ag
< >
Ag Ab
Move to
-
+ +
Ab放阳极，Ag放阴极
材

料
抗原 (Ag): 人血清.
抗体(Ab) : 抗人血清 巴比妥缓冲液(0.05 mol/L,Ph 8.6), 其他：电泳仪、琼脂板打孔器、载玻片、 毛细吸管、电表
抗原-抗体反应的特点:
1. 特异性：抗原-抗体的结合是特异性结合 2. 可逆性：抗原抗体结合是分子表面的非共价键 结合 3. 阶段性：抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段 可见的反应阶段 4. 比例性：抗原和抗体结合是否呈现可见的反应 现象与两者的分子比例密切相关
抗原-抗体反应受多种因素影响 1 . 电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠 作为稀释液 ，以供给适应浓度的电解质。 2 . 温度：一般使用反应在37度水浴或孵育箱中进行。
医学免疫学实验 (一)
实验室规则

穿好工作服。需要时严格进行无菌操作。禁止在 实验室吃东西、吸烟。 认真做好各项实验，各种实验物品按指定地点存 放，使用后的吸管、滴管及玻片等放指定地方。 实验中发生意外事故时，应立即报告及时处理， 切勿隐瞒或自作主张，不按规定处理。


实验室规则

爱护室内仪器设备，按使用规则操作，不得随意 拨动电器开关，显微镜用好后要功能部件复位。 实验室公用物品用完之后按原样放回，不得擅自 借出或带出到其它实验室。 节约使用实验材料，如不慎损坏了器材，应告知 相关管理人员登记。 实验完毕后整理操作区，关好水、电、门、窗。 需培养的材料要标记组名，姓名等。


思

考
在本实验中，影响吞噬细胞吞噬指标的实验因素 有哪些？
相 关 知 识
抗原-抗体反应包括凝集反应、沉淀反应、补 体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可用 已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知 的抗原检测未知的抗体。 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记 技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原 抗体反应的敏感性。
方

法
制板：取4 ml 煮沸的1. 5％ 巴比妥琼脂，立即浇注在 玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板

打孔：待琼脂凝固后，用打孔器按下图打孔，孔径3 mm，孔距5 mm。

加样：用微量加样器取Ag（人血清）20 μL分别加 于阴极侧1、2、3、4孔内。
阳极侧5、6、7、8各孔均加抗体（抗人血清）。加

方

法
白色念珠菌制备(have done)

将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时， 收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min， 用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌 悬液，4℃冰箱保存备用
方

法
吞噬细胞与菌混合培养 1).使用前混匀菌液。取巨噬细胞0.5ml加白色念珠菌 悬液0.5ml，置37℃温育30min。 2). 取1-2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观 察计数microscope(10 ×fold， and 40 ×fold) 。
沉淀环直径的大小与 Ag的含量成正比。以不同 浓度的标准 Ag 与固定浓度的 Ab 抗体反应后测得 沉淀环的直径作为横坐标，以Ag浓度为纵坐标可 绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从 标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定 抗原或IgG、 IgM、 IgA。
3. Precipitation Rea
做）。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡 5分钟。

剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口
(注意避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹腔液于试 管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清， 沉积细胞用1640离洗一次。最后沉积细胞用0.5ml含 10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1-2×106／ml)
⑤免疫电泳
[原理]
免疫电泳是电泳和双向免疫扩散相结合的一 种 Ag 方法。先将待测 Ag 加入琼脂板小孔中进行 电泳，因电泳速度不同可将待测Ag中的不同组分 分开 , 然后再与横槽中已知 Ab 进行双向扩散，每 一对相应的 AgAb 结合形成一条沉淀弧。根据弧 的数目、形状和位置，可分析样品中的Ag成分及 性质。


实验报告书写要求

年级、班级、实验者、同实验者、年月日 等填写清楚。

实验名称
原理
材料



方法 结果 分析讨论
对流免疫电泳
原

理
对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的结合。 Ag或Ab分子在一定的pH溶液中带有电荷，在电场 作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加在pH为 8.6缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白质都带负 电荷，泳向阳极。由于电渗作用，液体则流向阴极， 二者方向相反。
噬功能。
材 料

小白鼠(murine peritoneal macrophages) 白色念珠菌液（美兰染液着色） 1％可溶性淀粉溶液
美兰染液
解剖小鼠器械一套、显微镜、离心机、温箱等 试管、吸管、微量加样器、计数板
方


法
小鼠巨噬细胞制备：
实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1ml（已
-> The the c
The region o
E 6-5
ammatic representation of radial & double immu ipitation reactions in gels yield visible precipitin
双向扩散示
④火箭电泳
[原理]
火箭电泳是单向免疫扩散和电泳相结合的一 种定量检测 Ag的技术。在含已知 Ab 琼脂中打孔， 再加入待测Ag，通电后Ag定向地通过含有Ab的 琼脂，相应的 Ag和 Ab在比例合适处形成沉淀峰。 沉淀峰的高度与 Ag 浓度呈正比。该法可定量检 测Ag。
方法：

环状沉淀 絮状沉淀 免疫比浊

琼脂凝胶扩散： ①单向免疫扩散 ②双向免疫扩散 ③对流免疫电泳 ④火箭电泳 ⑤免疫电泳
①单向免疫扩散
[原理]
将某种特异性Ab混合于琼脂凝胶中，制成含 Ab 的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量 的Ag加入孔中。
Ag在孔中向四周作辐射状扩散，如Ag与已知 的 Ab 相对应，在两者比例适合处出现由免疫复 合物所形成的白色沉淀环。
对流免疫电泳中，Ag端为何接负极？
小鼠巨噬细胞吞噬功能的检测
原

理
巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞 噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共 同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞
的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞 噬功能，从而评价机体的免疫状态。

本实验拟检测小鼠腹腔巨噬细胞对白色念珠菌的吞
②试管凝集试验：半定量实验
已知Ag定量测Ab
用已知的定量的颗粒性Ag悬液直接与系列 稀释的待检血清（Ab）在试管内混合，经一定 时间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度 定量测定血清中的Ab水平及其效价。
试管凝集试验
管号 盐水(mL)
1 0.5 2 0.5 3 0.5 4 0.5 5 0.5 6 0.5 7 0.5
in the Ab-containing semisolid medium
-> The area is proportional to the conc. of Ag.
The region of equivalence
②双向免疫扩散
[原理]
将可溶性Ag和Ab分别加到琼脂板上相应的小 孔中，使两者各自向四周扩散，若 Ag 与 Ab 相对 应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合 处形成白色沉淀线。每一对应 Ag 和 Ab 可出现一 条沉淀线，根据沉淀线的有无、位置、形状以及 对比关系，可分析Ag或Ab成分。

结
果
高倍镜下观察计算

吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/100个巨 噬细胞)×100％ (本次实验只计算吞噬率)

吞噬指数= 100个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数 /100个巨噬细胞
**(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
注 意 事 项

1）菌与细胞混合后充分混匀非常重要。对于此实验， 菌与吞噬细胞之比10：1时吞噬作用容易观察和计数。 但是吞噬效果好，能真正反映实际情况又可被检测的比 例为1：1 2）菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30 min，如果 在37℃条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解， 也就不能计数为吞噬了菌的细胞。 3）滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用 的吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞 数就相应的少一点。
效价—— 能与定量Ag产生明显凝集现象（++）的血清 最高稀释倍数 。
2、间接凝集 将可溶性Ag（或Ab）包被在惰性颗粒载体 （红细胞、乳胶颗粒等）表面，再与相应Ab（或 Ag）反应，出现颗粒物凝集的现象。
（二）沉淀反应
定义：可溶性Ag（如血清蛋白、细胞裂解液或 组织液等）与相应Ab特异性结合，在一定条件下， 出现肉眼可见的沉淀物现象。
结 果

电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板，在黑色背景下观 察，凡AgAb孔间出现白色沉淀线者为阳性，孔间无 白色沉淀线者为阴性。如沉淀线不清晰可将琼脂板置 37℃温箱数小时后再进行观察，也可染色观察。

在Ag与Ab孔间出现沉淀线者为阳性。沉淀线形状、
位置等差异，与Ag、Ab浓度及分子量有关。
思
考

电泳中的两种移动：

电泳力使Ab 、Ag移向阳极。 电渗力使Ab 、Ag移向阴极。
电泳力
阴极
阳极
(-)
(+)
电渗力

Ab带负电荷少，分子量大，所以电泳力小于电渗 力，向阴极移动。
而Ag所带负电荷多，分子量较小，故其电泳力大

于电渗力，向正极移动。
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如Ag、Ab相遇，在比例适当时即形成白色沉淀 线。由于电场限制了AgAb分子的自由扩散，因
_ 1 2
样量以孔满为宜，但不可溢出孔外。 _
+ 5 6 3 4 7 8 1 5 6 3 4 7 8
+
100 V
50 min
2

电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸 或纱布与缓冲液相接，Ag端接负极电源，Ab端接 正极电源。按电场强度4~6 V/cm电泳50 min左右。

U=160V, I=43mA