影响ELISA结果的常见因素及有效控制

影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法

影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法摘要】酶联免疫吸附试验是免疫酶技术中固相酶免疫测定的一种技术。

ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但是操作中的各个环节对试验的检测结果影响较大，如不注意排除干扰因素，有可能导致显色不全、花板等现象。

现将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。

【关键词】酶联吸附试验影响因素【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）09-0369-021 试剂的因素1.1 试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。

虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。

更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。

使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。

因此。

选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

1.2 试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。

因此，在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。

2 样本的因素2.1 标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。

2.2 标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使实验出现非特异性显色。

因此，ELISA检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，5 d之内应4℃保存，1周后检测应低温冻存；同时，收集标本采用无菌试管，可防止标本的污染。

影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法

标试剂的批号是否相同，不同批号试剂不得混用。
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问题4：质控品灵敏度偏高。
处理意见：卫生部临检中心的质控品存在批间批内差异。实验室相关条件改变导致质控变化，
看阳性对照品是否有明显变化。
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问题5：多次实验灵敏度一直偏低。处理意见：A保存环境不规范。
B孵箱温度不足。 C温育时间不足。
(3)孵育过程中出现的问题
1.温箱孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合，难以清洗彻底。 3.孵育时温度不符合说明书的规定范围。
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(4)洗板过程中易出现的几点情况
1.采用手工洗板,孔与孔之间液体容易交叉，切不可随意洗板。
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处理意见：D假阳性标本表现在临界值附近较多，通常与当时实验的水平有关，注意检查实验条件的波动。 E避免加样时间过长。 F由于试剂盒灵敏度过高而造成
临床假阳性偏高的结果。
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问题8：多次实验重复性差。处理意见：A加样后充分混均。
B尽可能使用同一加样器，装紧枪头。
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问题6：单次实验中出现假阳性处理意见：注意实验过程中的影响因素，特
别是实验中的洗板应设置浸泡 30---60秒时间。
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问题7：临床实验中出现假阳性偏高。
处理意见：A注意检查洗涤液中结晶部份是否完全溶解。
B注意检查实验中所使用的仪器设备是否定期校准。
C注意检查实验中所用的板、酶标试剂的批号是否相同，不同批号试剂不得混用。

ELISA试剂盒试验的影响因素

ELISA试剂盒试验的影响因素
ELISA试剂盒，即酶联免疫法。

ELISA法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，并具有操作简便、无放射性危害的优点，因而多年来广泛应用于各高校、医院、血站和科研机构的实验室中。

影响ELISA实验的因素：
我们技术人员通过几年的实验观察，认为影响ELISA实验的因素有如下三方面：
一、试剂盒
1、抗原、抗体活性对效价的影响：主要是试剂中抗体（或抗原）的效价降低或失活，结果不易判断。

再有ELISA试剂盒灵敏度高，对杂质的反应灵敏度也高，实验中空白对照OD值偏高或假阳性；
2、酶结合物浓度过高，也会导致OD值假性增高。

二、试验仪器
1、加样器是否经过校正，酶免测定血清用血量很少，如手工加样器的性能不好，吸取样品不，会使结果忽高忽低；
2、每次洗板前，应检查洗板机针孔有无堵塞。

三、操作
1、检测前先将试剂盒从冰箱取出置室温平衡20min后使用，试剂用完及时放回冰箱冷藏，以免造成试验结果假性降低；
2、加样时注意勿触及包被板底部，以免擦伤包被物使抗体（抗原）脱落而影响实验结果的准确性；
3、洗涤不充分，会使结果假性增高，过分洗涤呈假阴性；
4、比色时应保持包被孔底部无异物、无水汽，特别是冬季板从37℃水浴箱取出时，底部留有水汽，应将板底擦干后进行比色，水汽或孔内气泡也会使OD值升高；
5、抗原与抗体反应达到平衡，依赖于温度与时间。

温度高于45℃易引起失活及标记物脱落，温度低于4℃，影响反应速度。

总之，由于ELISA试剂盒实验的影响因素较多，在实际工作中操作规范、仔细，避免和排除各种因素的影响，使之得到准确可靠的检验结果。

ELISA测定结果的影响因素及其排除方法

【专家讲座】EL ISA 测定结果的影响因素及其排除方法候小玲1,孙圣明2作者单位:1.湖南省石门县人民医院检验科415300;2.湖南省常德市第三人民医院检验科415000作者简介:候小玲(19562),女,湖南石门人,主管检验师。

研究方向:免疫学检验。

【主题词】　酶联免疫吸附测定方法【中图分类号】　R 446.63 【文献标识码】　A 【文章编号】　100926647(2007)1623712202 目前酶联免疫吸附试验(Enzym e 2L inked I mm uno so rbent A ssay ,EL ISA ,简称酶免)是临床实验室最常用的一种标记免疫方法。

EL ISA 在基础研究和常规的临床实验室中有着广泛的适用性,具有操作简便,灵敏度较高,试剂成本低,环保,适于大批量人群抗原抗体筛查等优点,已广泛应用于肝炎病毒,艾滋病毒筛查,癌胚抗原,甲胎蛋白和激素等项目的检测。

但EL ISA 法测定结果的影响因素较多,影响因素主要有:(1)试剂因素;(2)标本因素;(3)实验原理或操作方法;(4)环境因素等。

因此在临床检验工作中,除正常反应外,还常会出现一些假阳性和假阴性等异常结果。

总结如下。

1　试剂因素试剂质量是影响检测结果的直接因素,对于生产厂家出品的试剂盒,其抗原抗体的纯度,标准品定值的准确性,抗体的亲和力、滴度和特异性,标记物的比活性或免疫活性等[1],均对测定结果产生直接影响。

还有试剂盒的稳定有效期,运输条件及储存方式等也均会对结果产生一定程度影响。

在EL ISA 试剂盒中阴性对照的质量也显得尤为重要,当阴性对照吸光度(OD 值)较高,夹心法易产生假阴性,而竞争抑制法易产生假阳性。

还有竞争抑制法中,EL ISA 检测结果与实验用中和抗原浓度和含量有极大关系[2],这也最为我们所忽视。

中和抗原必须严格滴定,如果中和抗原浓度过高,试剂盒敏感性下降,检出率低,假阴性增多[2]。

试剂盒整体上,试剂灵敏度主要取决于抗体亲和常数(K 值)和抗体的滴度,还取决于标准曲线的斜率和零标准管的重复性两个因素[1]。

ELISA检测过程中影响因素及防控措施分析

３０８４．
之前生育，避开了ＤＳ和１８一三体综合征高风险年龄段。目前
产前筛查的指标均以孕周为基础，而孕妇提供的孕周与实际孕
［４］杨灿锋，陈道桢，王峻峰，等．影响唐氏筛查准确性相关问题的分析［Ｊ］．中国优生与遗传杂志，２０１１，１９（４）：１１７ — １１８．［５］ＰａｌａｃｉｏＭ，ＪａｕｎｉａｕｘＥ，ＫｉｎｇｄｏｍＪ，ｅｔａ１．Ｐｅｒｉｎａｔａｌｏｕｔｃｏｍｅｉｎ
・
［Ｊ］．ＵｌｔｒａｓｏｕｎｄＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ，１９９９，１３（１）：５８ — ６２．
（收稿日期：２０１２ — ０７ — ０４）
经验交流・
ＥＬＩＳＡ检测过程中影响因素及防控措施分析
周相差２周即可导致三项指标评估的危险率差异１Ｏｌ４ｊ。本研究筛查者孕周集中在１５～１９周，１４、２Ｏ周所占比例较少，各孕周组筛查高风险率比较，无统计学差异，所以要准确计算孕周。本研究显示年龄大于３５岁的孕妇ＤＳ、１８一三体综合征和ＮＴＤ筛查高风险率高于小于或等于３５岁的低龄孕妇。表３显示筛查高风险孕妇发生妊娠期高血压综合征、胎儿发育迟

ELISA试验中常出现的问题及解决方法

ELISA试验中常出现的问题及解决方法作者：吴召坤，巩雪英，刘粉红来源：《兽医导刊》 2016年第8期吴召坤巩雪英刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。

这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。

一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。

试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。

2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。

3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。

温育时间不足，温度过低都会影响显色。

4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。

5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。

6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。

二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。

1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。

2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。

3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。

重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。

ELISA常见问题

1、ELISA试验的稳定性问题做ELISA实验时，结果老是重复性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的结果就截然不同，上午做时其OD在1.5，下午做时就是0.9了，所以都没有办法下结论，为什么会差异这么大呀？（1）多设平行空孔，请别人代劳，以判断究竟是否操作问题（2）对于活性非常高的包被物和酶标记物，如果第一次选择的范围恰好在其平台位置边缘，那么在重复的时候，每次取样带来的微量误差就很容易导致大的偏差了，特别是线性比较好的原料试剂，这个就很正常了。

建议每次取样的时候只使枪尖一点点位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗体or酶而使结果重复不上。

2、酶不稳定，有何高招？（1）保存浓度尽量高些，（2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保护剂，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解。

（3）加入50%甘油-20度保存、避免反复冻融。

（4）还可以加入防腐剂防止长菌（注意不能用叠氮钠，其对HRP活性有很大影响）（5）现在一些公司也有商品化的酶标保护剂供应，可以考虑一下酶类的稳定性与保存方法的很大关系。

干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可。

液态稳定性较差，贮藏时应注意以下几点：1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易降解、变性。

2、一般需加入防腐剂和稳定剂，酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。

此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。

3、贮藏温度要求低，避免反复冻融。

3、ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？做夹心法ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？最大的原因是封闭的效果不好，应该调整封闭液；可以尝试不同的封闭剂（BSA、胶脂奶粉、明胶等）、不同的封闭浓度、时间，试试哪个效果好阴性的里面的其他蛋白起到了封闭的效果4、边缘的阴性OD值老是比中间的偏高，什么原因呢？我做ELISA时，有一段时间在板的最后一条板孔的阴性的OD值经常比在中间的高，有时候高出0.1个OD，导致实验经常重复，但原因也找不到在哪里？这可能是由于ELISA的边缘效应造成的。

ELISA实验操作中常见问题分析

ELISA实验操作中常见问题分析严峻溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。

2、试剂的阻碍a.分子量大。

合成肽采纳化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。

d.纯化难度大。

基因工程抗原的纯化技术难度较大。

合成多肽抗原是按照蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。

合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小；b.一样只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳固性差。

国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏锐性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。

有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳固比较差。

使用质劣的试剂必定导致结果的假阳性或假阴性。

因此。

选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

•选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳固性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的要紧依据。

•要注意试剂的批号和出厂日期，尽管试剂的有效期多为1年。

最好选择刚出厂的试剂使用。

不同厂家的试剂不能混用。

不同方法学的检测试剂，会使两对半结果显现一些不同。

例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。

影响ELISA试验结果操作的因素总结

影响ELISA试验结果操作的因素总结操作的影响因素酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特别的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上进展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果推断较为客观，是目前试验室检测抗原抗体*经济、*普遍的试验诊断方法。

影响ELISA试验结果操作的因素总结如下：1 、试剂的预备试剂的质量如抗原抗体的纯度及亲和力、标记物的比活性、滴度及特异性等直接影响检测结果，为保证检测质量，全部试剂必需经国家食品药品监督管理总局注册批准、批检测合格，临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且在有效期内才有使用价值。

不同厂家试剂敏感性、特异性不尽相同，有报道不同厂家酶标板孔间 A 值差大小可达 15%，标记酶的活性及显色液的稳定性也相差较大，所以合理有效的试剂选择尤为重要，对 ELISA 试剂盒应正确选择，定期评价并建立科学的接收标准，结合常规血液筛查状况，对实际的均一性、适用性、稳定性，选出灵敏度、特异度及精密性合适的试剂保证检测结果的精确。

有报道不同厂家-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶结合物溶液对检测结果有区分，配制抗 HCV-cAg 酶结合物溶液前应检测小鼠-IgG 与产品的适配性。

其次试剂盒的储存方式、运输条件及有效期均为影响检测结果的重要因素，试剂盒一般2~8℃冰箱保存，留意不要紧贴冰箱储存室后壁以防止试剂冻结失效，可避开使用时试剂受温差影响导致酶标板上凝集小水珠及反应消失温差而影响抗原抗体的反应。

使用前需将试剂盒放置37℃恒温箱温育30min，且不同厂家、不同批号的试剂不能混合使用。

剩余试剂应准时放入干燥剂密封保存在2~8℃冰箱，试剂打开后一周内有效，同时留意做好室内质检，确保试验结果的牢靠性。

不同方法学的检验试剂会使乙肝两对半结果消失不同，如临床操作中电化学检测 HBsAg 呈阳性，而采纳 ELISA 检测则呈阴性，此外，使用单抗或多抗试剂对检测结果同样造成肯定的影响。

ELISA检测过程影响因素及操作注意事项

另外，标本要做到纯净无杂质，杂质会对实验造成一
３温育
ＥＬＩＳＡ检测中抗原、抗体反应的完成需要一定的温度和时间，这一保温过程称为温育。不同的试剂盒采取的温
育温度可能会有差异，有４３ ℃、３７ ℃、室温和４ ℃等，温育
中图分类号：￥８５２．４５文献标识码：Ｂ文章编号：１００４ — ５０９０２０１４０１ — ００４６ — ０２
酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）是将已知的抗原或抗体结合在固相载体上，然后加入待测样本和酶标记的抗体或抗原，使其与预先包被在固相载体上的抗原或抗体发生特异性反应，用洗液洗去多余的游离成分和干扰物质后滴加底
中很难保证质量完全一致，为避免结果差异，应尽量选择同一批次的试剂对样本进行检测。试剂盒应在有效期内使用，尽量做到随用随买，一般
吸光度值进行定量分析。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型免疫测定技术，兼具抗原抗体反应的特异性和酶催化的高效性，具有灵敏性、特异性高，重复性好，检测速度快及适宜大批量检测等优点，成为目前应用最为广泛的酶免疫测定技术。被广泛应用于临床医学、环境污染控制、食品质量安全监测、动物疫病诊断及畜产品药物残留等领域。ＥＬＩＳＡ检测操作简单，但人为因素对实验结果影响较大。样本、试剂、加样、洗板等过程都会对结
定的干扰，产生非特异性反应，使检测结果不准，可离心沉淀后取上清液检测。冷藏或冷冻的样本检测时需回温至

浅谈导致ELISA测定异常结果的原因与对策

浅谈导致ELISA测定异常结果的原因与对策作者：胡爱明，朱淑琴，刘红道，等来源：《江西畜牧兽医杂志》 2012年第3期胡爱明1，朱淑琴1，刘红道1，鄢涛1，龙必美2（1.吉安市畜牧兽医局，江西吉安 343000；2.吉安市吉州区曲濑畜牧兽医站）酶联免疫吸附试验（ELISA）技术自1971年问世以来，因其具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点被广泛应用于兽医临床检验中。

近几年，随着动物疫病形势复杂化，畜产品质量安全意识与日俱增，ELISA测定被主要应用于大量的血清、尿、饲料等样品筛检中。

但在实际ELISA测定操作中，影响ELISA测定结果准确的因素较多，导致出现白板、花板、弱板等不正常现象和假阳性、假阴性等异常结果。

笔者对ELISA测定过程中出现一些问题进行分析和总结，浅谈一些个人看法，以期给同行带来一些启发，提高ELISA的测定质量。

1 样品处理不严格ELISA测定结果的判定是通过辣根过氧化物酶（HRP）与特异性结合产生的抗原-抗体复合物相互作用后显色与否来实现的。

对样品进行筛选或处理能降低试验中因样品因素导致假阳性和假阴性等异常测定结果的可能性。

如溶血和被细菌污染的样品大大提高样品中辣根过氧化物酶（HRP）或类似过氧化酶活性物质的浓度，从而使ELISA出现显色反应，导致假阳性的出现；在冰箱中保存过久的样品由于IgG抗体聚合成多聚体，导致使用间接法测定的ELISA试验中本底过深，出现假阳性。

反复冻融会使样品效价降低，导致假阴性出现。

一般来说，在冰箱4℃~8℃冷藏保存的样品需一周内测定，一周以后测定的-20℃保存，长期保存需多次测定的样品要少量分装冰冻保存。

2 试剂准备不到位选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、操作方便省时、正规厂家的试剂。

同时，切忌混用同厂家生产的不同批号的试剂，检测时尽量不用临近有效期的试剂。

另外，试剂在使用前应平衡至室温（约25℃），这是确保不出现异常测定结果的关键做法。

一般室温放置20~30 min，冬季室温过低，可将试剂放置于37℃恒温箱10 min以上，这样可以避免ELISA试验反应不充分、弱阳性样品检测假阴性结果等现象的发生。

酶联免疫吸附试验的影响因素

酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。

它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。

在进行ELISA实验时，有多个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。

1.试剂的质量ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。

这包括酶标记抗体和底物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。

选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。

2.样本处理和储存条件样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。

样本的收集、保存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。

如血液或组织样本的离心速度、温度和时间等要控制一致。

另外，样本的冻结和解冻过程也需要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。

3.特异性抗体的选择ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。

抗体的选择要考虑其亲和力、特异性和纯度等特性。

如果抗体不够特异性，可能会导致非特异性结合和假阳性结果。

因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关重要。

4.孵育条件和时间孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。

这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。

不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。

孵育温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。

5.光度计的精度和校准ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果的准确性和可重复性至关重要。

定期检查和校准光度计以确保其准确性，并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。

6.数据分析和计算ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。

如对标准曲线进行拟合和计算待测样品的浓度等。

合理的统计分析和数据处理能够提高实验结果的可靠性。

ELISA法检测乙肝五项影响因素及结果分析与对策

内不易洗净，可出现非特异性反应，残留在孔内的血红蛋白具有妇ＨＢｓＡｇ的检出；而且其所生产的生新几也常出现｝玎３ｓａｇ阴性，过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本ＨＢｅＡｇ阳性和ＨＢｃＡｂ阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属
经验爻流
ＥＬＩＳＡ法检测乙肝五项影响因素及结果分析与对策
曹贺涛
宁夏石嘴山市疾病预防控制中心７５３０００
【摘
要】随着临床免疫学不断发展，ＥＬＩＳＡ法比较灵敏，不需特殊设备，可以定性分析，所以应用发展迅速。但在实际工作中，
１．２标本凝固２～２ｈ开始可将二者连接起来造成假阳性，采用５６ ℃３０分钟灭活补体可降
凝固，１８～２４ｈ血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快低假阳性率，高浓度的ＡＦＰ（如孕妇），在储存过程中可能形成
可能会因操作不当而出现一些异常指标。总之，一点小小的疏忽、失误可能造成检验结果的偏差，给患者及家属带来物质
精神上的损失，给临床确诊带来麻烦。【关键词】ＥＬＩＳＡ；乙肝两对半；影响因素；结果分析
ＥＬＩＳＡ法广泛用于乙肝两对半检测，但ＥＬＩＳＡ测定中影响因ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｇ假阴性；或ＨＢｅＡｂ和ＨＢｃｈｂ的假阳性。素较多，有些因素会导致结果假阳性或假阴性，本文就ＥＬＩＳＡ测

酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法

酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定蛋白质或抗原的浓度。

然而，在进行ELISA实验时，存在许多可能影响实验结果的因素。

本文将介绍一些常见的影响因素及如何处理这些问题。

1.样品质量：样品质量是影响ELISA实验结果的一个重要因素。

如果样品质量不合格，可能会导致错误的实验结果。

处理方法包括：-选择合适的样品储存条件，避免样品的变性、降解等问题。

-对样品进行适当的纯化和浓缩处理，以提高样品的纯度和浓度。

2.抗体选择：在ELISA实验中，正确选择适合的抗体也是非常重要的。

处理方法包括：-确保抗体的特异性和亲和力，避免与其他非特定蛋白结合。

-对抗体进行亲和纯化，以提高抗体的纯度和活性。

3.反应条件：ELISA实验中的反应条件包括温度、时间、pH等，这些条件的选择直接影响到实验结果的准确性。

处理方法包括：-对反应条件进行优化，确定最佳的温度、时间、pH等参数。

-控制反应时间，避免反应过长或过短而引起实验结果的偏差。

4.检测方法：ELISA实验中常用的检测方法有酶标记物检测、放射性同位素检测、荧光检测等。

不同的检测方法对实验结果的影响也不同。

处理方法包括：-选择合适的检测方法，根据实验的目的和需要进行选择。

-对检测方法进行优化和标准化，以提高检测的准确性和灵敏性。

5.交叉反应：ELISA实验中，样品中的其他成分可能会引起交叉反应，导致实验结果的误差。

处理方法包括：-使用对特定抗原具有高度特异性的抗体，避免与其他非特定抗原结合。

-对样品进行适当的稀释，以减少交叉反应的可能性。

6.数据分析：ELISA实验的数据分析是实验结果的重要环节。

处理方法包括：-使用适当的统计方法对实验数据进行分析，确定浓度或活性的可靠性。

-进行实验重复和平行实验，以确保实验结果的可重复性和准确性。

影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法

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三.血型常见问题分析
1.关于效价的问题：目前公司内部质量规程规定A,B细胞均需达到1：128 O细胞需达
到1：8。 2.关于凝集的问题：
A , B细胞 1：128 + O细胞 1：8 + 此处的“+”为肉眼可见清晰的凝集颗粒。 3.关于变色及溶血的问题： ①当细胞近效期时，有可能出现细胞浊液颜色发暗红，属正常现象。 ②正常细胞沉淀后，颜色鲜红色，摇匀后细胞浊液颜色鲜红。 ③当细胞受污染或细胞破碎，细胞沉淀后颜色暗红甚至发黑。细胞浊液暗红或发黑。当细胞本身衰老或破碎后，有可能引起效价偏低，凝集不实。
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问题6：单次实验中出现假阳性
处理意见：注意实验过程中的影响因素，特别是实验中的洗板应设置浸泡 30---60秒时间。
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问题7：临床实验中出现假阳性偏高。
处理意见：A注意检查洗涤液中结晶部份是否
完全溶解。
B注意检查实验中所使用的仪器设
备是否定期校准。
C注意检查实验中所用的板、酶标
D注意检查实验中所用的板、酶标试剂的批号是否相同，不同批号试剂不得混用。
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问题4：质控品灵敏度偏高。
处理意见：卫生部临检中心的质控品存在批间批内差异。实验室相关条件改变导致质控变化，
看阳性对照品是否有明显变化。
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问题5：多次实验灵敏度一直偏低。
处理意见：A保存环境不规范。 B孵箱温度不足。 C温育时间不足。
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问题3：日常使用中出现弱阳性标本漏检。
处理意见：A标本本身由于各种因素影响而表现

浅谈影响ELISA结果因素分析

浅谈影响ELISA结果因素分析ELISA法即酶联免疫吸附测定法，该方法的检测原理主要是通过待测物和酶连接，使得抗原与抗体发生特异反应，通过观察底物和酶颜色的变化得出检测结果，ELISA法根据种类和变化能够分成双抗体夹心法、间接法、竞争法以及捕获法，其中双抗体夹心法主要用于抗原的检测，间接法主要用于抗体的检测，竞争法可用于抗原与抗体的检测，捕获法则用于测定血清中某种抗体亚型的成分[1]。

酶联免疫吸附测定法具有灵敏性高以及特异性高的特点，在临床上应用十分广泛，发挥出十分积极的临床价值，然而存在诸多因素诸如试剂、标本、操作方法以及环境等方面会影响检测结果的准确性，本文主要对影响ELISA结果因素进行分析，并给出针对性的解决措施，具体信息如下。

1 试剂方面的因素ELISA法的检测结果直接受到试剂质量优劣的影响，试剂盒的生产厂家和质量、标记物的免疫活性、抗原抗体的纯度、试剂是否有效与试剂的储存方式等方面均会对ELISA法的检测结果有程度不一的影响[2]。

为避免上述情况影响检测结果的准确性，①在检测过程中需要确保ELISA 试剂盒中阴性对照的质量，从而避免假阴性与假阳性的出现；②抗原的中和必须准确滴定，防止由于抗原浓度过低或者过高影响试剂盒的敏感性而导致假阴现象的发生；③重视试剂的质量，给予完善的室内质控与定期开展室间质量评估；④根据试剂盒的开封时间与保存的状况来实施全点定标，进而保障检测结果的准确性；⑤有研究显示ELISA法的检测结果不准确很大程度上是受到试剂质量的影响，因此生产厂家必须重视试剂的质量，有必要时可通过人新鲜标本方法学来评估试剂的质量。

2 标本方面的因素实验标本对ELISA法的检测结果也具有很大的影响[3]，主要包括内源性与外源性物质干扰。

内源性物质干扰主要包括药物、嗜异性抗体、人抗动物抗体、代谢产物、类风湿因子以及补体等，然而在ELISA法的检测过程中可通过下述方法处理标本来降低内源性物质干扰：①通过将抗原结合片段取代免疫球蛋白（IgG），将结晶片段（即Fc片段）消除，这样能够很大程度降低类风湿因子、嗜异性抗体以及人抗动物抗体对检测结果的干扰；②通过热处理的手段（56℃处理30min，63℃处理10min）与应用乙二胺四乙酸（EDTA）对标本进行稀释与2一巯基乙醇对标本进行稀释，以降低补体与类风湿因子对检测结果的干扰；③在标本中添加阻断剂如10％正常人血清和1％正常动物血清；④若检查发现标本中存在血红蛋白、胆红素以及血脂等成分时，必须重新采血检查[4]。

ELISA酶免自动化检测影响因素及对策

世界最新医学信息文摘 2017年第17卷第40期201投稿邮箱：ｓｊｚｘｙｘ８８＠１２６．ｃｏｍ·血液管理·0 引言酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）是目前我国采供血机构用于献血者血液病毒筛查的法定方法［１］。

全自动酶免分析系统的应用提高了ＥＬＩＳＡ检测的精确度和特异性，但ＥＬＩＳＡ测定影响因素较多，而且在操作中有一定的技术要求。

现就ＥＬＩＳＡ酶免检测的影响因素及对策加以分析及探讨：1 人员与环境自动化仪器检测要求操作人员应具备扎实的ＥＬＩＳＡ检测基础知识和操作技能，掌握仪器设备的工作原理和使用注意事项［２］，严格按照ＳＯＰ操作。

我室环境温度控制在１８－２６℃，湿度３０％－７０％。

实验室要配备应急电源。

2 ELISA 酶免检测方法学性能验证对实验室所采用的ＥＬＩＳＡ方法进行有效性能验证，才能确保检验结果准确可靠。

验证前要对需要使用的检测仪器设备如ＳＴＡＲ加样仪、ＦＡＭＥ全自动分析仪等进行校验，确认仪器各项功能指标均正常。

ＥＬＩＳＡ检测方法学项目属于定性项目我室验证的参数：批内精密度验证和批间精密度、符合率，灵敏度和特异性、检出限（临界浓度）确定、人员比对及仪器比对，检测过程中采取质量控制措施，尽可能保证检测系统处于一个稳定状态。

3 标本因素标本质量是整个ＥＬＩＳＡ实验质量保障的第一步，我室使用的酶免采血管是ＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝的真空采血管，采血管要做好使用前评价，使用后要定期评价。

标本标识要保证唯一性，保证标本与血液同源，采血环节防止贴错标识，防止血液留串样，血液制备、包装环节防止贴错标识。

为防止标本被稀释最好旁袋留样，使用导管留样要注意留样顺序，尽可能避免从血袋再次留样。

脂肪血对酶免检测有干扰作用。

为避免采集脂肪血，加强献血宣传健康体检时对献血者饮食情况问询，健康体检时最好采集静脉血判定。

溶血可能造成ＥＬＩＳＡ假阳性，为防止溶血，旁袋留样最好使用９＃以上针头，使用一次性注射器留样，抽取及注入血液切不可用力过大，旁袋自带留样针的，在整个操作过程中不可挤压旁袋，以避免挤压红细胞造成溶血。

ELISA结果影响因素

样本保存不当
01
保存温度
样本保存的温度过高或过低，可能会影响ELISA结果。一些蛋白质成分
可能会因为温度变化而发生变性，导致其与抗原或抗体的结合能力改变。
02
保存时间
样本保存时间过长，可能会导致某些成分降解或发生变化，从而影响
ELISA结果。
03
保存介质
用于保存样本的介质，如某些化学物质或防腐剂，可能会与待检测成分
01
仪器设备故障可能导致ELISA实验结果不准确，如加样器、洗板机、酶标仪等出现故障，影响实验的重复性和准确性。
02
故障可能导致加样不准确、洗板不彻底或酶标仪读数不稳定等问题，进而影响实验结果。
仪器设备未校准
仪器设备在使用前需要进行校准，以确保实验结果的准确性。
未校准的仪器可能导致加样量不准确、吸光度读数偏差等问题，进而影响ELISA结果的判定。
详细描述
实验室湿度应控制在40%-60%之间，以避免实验材料受潮或过度干燥。如果实验室湿度不稳定，可能会导致抗体和抗原的变性，从而影响实验结果。因此，实验室应安装湿度计，并定期检查以确保湿度的稳定性。
实验室清洁度
总结词
实验室清洁度对ELISA结果的影响不容忽视。灰尘、污渍和微生物污染可能影响实验结果，导致假阳性或假阴性。
详细描述
实验室应保持清洁，每天清洁台面、地面和仪器表面，每周进行一次全面清洁。实验操作过程中，应避免交叉污染，使用一次性手套和实验服。此外，实验室应定期进行微生物检测，以确保环境卫生符合标准。
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加样量不准确
温育时间不足或过长
温育时间对ELISA实验结果影响较大，温育时间不足或过长均可能导致抗原抗体反应不充分，降低实验敏感性。

ELISA法检测的影响因素及其对策

．
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堕堂Ｑ３生８旦箜３鲞箜塑１，！
・
述评・
ＥＬＩＳＡ法检测的影响因素及其对策
谭立明
（南昌大学第二附属医院检验科。江西南昌３３０００６）
等［９－１１］通过实验报道样品溶血血红蛋白浓度不大于
４．９５ｇ／Ｌ，对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法检测结果均元影响徐传国［１２】认为溶血易导致弱阳
性标本漏检．黎学东等『１３，１４１认为虽然溶血会对ＨＢ —
望提高ＥＬＩＳＡ法检测的准确性
１样本的影响因素
一
正．且有非常显著性统计学意义１．２脂浊孙辉等通过实验报道乳糜样品含福尔
马肼浊度小于１４６０ＦＴＵ的乳糜时．对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法的检测结果均无影响。汪建国等认为脂质颗粒会黏附在反应孔内壁．使
ＥＬＩＳＡ法检测的影响因素及相应对策做一综述．提高检测的准确性关键词：酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）；影响因素：对策
中图分类号：Ｒ４４６．６１文献标识码：Ａ文章编号：１６７４ — １１２９（２０１３）０４ — ０３００ — ０６
操作流程中可能出现的相关问题展开笔述．对

elisa结果影响因素

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ELISA实验原理
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性并能相互特异性结合。
抗原抗体复合物与酶标二抗结合，加入合适的底物，在酶的作用下显色，颜色深浅与特异性抗体成比例关系，可进行定性和定量分析。
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ELISA检测方法
结果影响因素——试剂因素
试剂的选择
试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。不同厂家的试剂在使用效果上存在差异。要选购知名度相对高、信誉可靠的试剂。
重视试剂质量同时有效地进行室内质控以及参加室间质量评价。特别是室间质评可以发现实验本身不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，帮助校正使结果具有可比性。
间接法和夹心法ELSIA
竞争法ELISA
（阳性孔呈色深于阴性孔 ) （阳性孔呈色浅于阴性孔）
1.定性结果可以用肉眼判定 1.阳性判定值法
2.阳性判定值
2. 抑制率法
3.标本/阴性对照比值
3.不可用肉眼判断
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结果影响因素
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时会出现一些错误结果。引起错误结果的原因主要有：1、标本因素 2、试剂因素 3、操作因素 4、环境因素。
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结果影响因素——标本因素
标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。
内源性物质
类风湿因子补体
嗜异性抗体自身抗体
医源性诱导的抗体
交叉反应物
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外源性物质