基因工程的主要技术与原理-核酸分离 电泳
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1)液氮研磨材料成粉末，置于离心管中 再加入适量2×CTAB提取液，充分混匀， 65℃水浴1hr； 2) 4℃，12000 r/m，离心10 min，吸 取上清液转入新的离心管； 3)加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，
裂解细胞膜
沉淀材料残渣
变性、沉淀 蛋白质
静置5min后于4℃、12000 r/min，离
痘病毒
质体
细胞器DNA:主要指线粒体DNA和叶绿体DNA,是真核 生物所特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸 作用和光合作用相关的基因。可用于分离目的基因 和构建克隆载体。
叶绿体DNA比较
双子叶植物 单子叶植物 121（菠菜）-154kb（豌豆） 151（玉米）-182kb（浮萍）
藻类
132（裸藻）-191kb（衣藻）
1.将菌落转接入约5ml含相应抗生素的LB液体 培养基中，37℃恒温振摇，培养过夜(12hr)； 2.取1.5 ml培养物转入微量离心管中，4℃， 12000 r/min离心30 sec，倒掉培养液，尽可 能清除残余液 (可重复2-3次) ； 3. 弃培养液，使细菌尽可能干燥； 菌体的收集 细菌的培养
DNA的来源及用途
染色体DNA:分子巨大，1000Kb-106Kb。 是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料； 也可用于构建染色体载体和染色体基因整合平台。
染色体DNA比较
人 植物 果蝇 酵母 细菌 天花病毒 3x106 kb 2x105~1x108 kb 1.28x105 kb 15,000 kb 3300~4200kb 288 kb 196 kb 几~100以上kb
植物总DNA的提取
一般地说，总DNA主要是指基因组DNA(genomic DNA), 即细胞核内的染色体DNA分子。 核DNA分子呈极不对称的线状结构,一条染色体为一个 DNA分子。高等植物核DNA大约含有10 9 bp，其长度与直 径的比例极不对称，使其对机械力十分敏感。很难分离 出它的完整分子。分离纯化过程中，DNA分子的断裂是 很难避免的。
裂解菌体细胞 控制时间； 操作柔和。
6.加入300μl冰预冷的溶液III，后温和振荡
质粒DNA的分离 中和NaOH； 沉淀蛋白质和 基因组DNA。
10秒钟，混匀后，置于冰上3-5min；
溶液III： 3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸
7.4℃，12000 r/min离心5min，将上清转至 另一离心管中；
2.机械法：
1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌 2)匀浆法：搅切器(blender)，混合器(mixer)，
3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球同时致冷，
在未融熔前用研杵磨成粉末
4)超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行
细胞破碎，效率更高
3.其它方法：
1)煮沸法： 2)冻融法： 3)干燥法：
湿热灭菌：一次性用品，如微量移液吸头(tip)、微 量离心管(eppendorf tube)等，先用0.1%的焦磷酸二 乙酯(DEPC)处理过的水浸泡过夜后，121℃湿热灭菌
30min;
电泳用具：最好专用；用前洗涤剂清洗干净，再用
3%H2O2和0.1%的DEPC水浸泡后，冲洗干净方可使用。 操作者防护：实验过程中必须带手套，并常换手套， 尽量避免外源RNase的污染； 内源RNase：采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质
心10min；
4)将上清液转入另一离心管，加入等体积 氯仿，充分混匀，4℃、12000 r/min，离 心10 min；
进一步变性、沉淀 蛋白质，清除残余 苯酚
沉淀DNA
5)将上清液转入另一离心管，加入等体积 异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰 浴20-30 min，沉淀DNA；
6)挑出絮状DNA沉淀，70%乙醇中洗涤2次； 7)无水乙醇洗涤1次； 8)风干后，加适量TE缓冲液或无菌双蒸水 溶解DNA，-20℃贮存备用。
洗涤、Biblioteka Baidu燥DNA
溶解、保存
DNA电泳结果
大肠杆菌质粒DNA的提取
克隆载体分子及装载于载体中的克隆化 基因，大多是以质粒的形式保存在大肠杆 菌中，因此，许多基因操作都离不开大肠 杆菌质粒DNA的提取，其步骤主要有3个：
细菌的培养 细菌的收集和裂解
质粒DNA的分离和纯化
碱裂解法提取E.coli质粒DNA程序及原理
2) 硅胶膜纯化法： RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与 DNA纯化思路相似； 当含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA 被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开；
在低盐浓度条件下，RNA被洗脱液洗脱下来；
（三）mRNA的纯化
Northern杂交可以使用总RNA,而构建cDNA文库 时，则必须得到纯化的mRNA； 亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3‘端的
沉淀、洗涤DNA 也可用等体 积异丙醇沉淀 质粒DNA；
14.风干后，溶于20-50μlTE缓冲液或无菌 溶解备用 双蒸水中； 适度干燥； 15.加入适量无DNA酶的RNase(20μg/ml)， 消化RNA 37℃处理30min； 16.琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃贮存备用。
开环螺旋 线状分子 超螺旋
基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，能 与核酸形成复合物； 在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，当降 低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时从溶 液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同白 质、多糖类物质分开；
然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，
(Nucleic Acid Gel Electrophoresis)
电泳：带电物质在电场中向相反电极
移动的现象称为电泳。
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，
用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；
优点：
（1）便于分离； （2）便于检测； （3）便于回收。
一、核酸凝胶电泳的基本原理
核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；
mRNA是单链的，极易受到核酸酶的攻击而导致 降解。对RNA的操作要求比DNA更为严格。
（一）控制潜在的RNA酶活性
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒(0-65℃均具活性)；抗变性剂。
2) 解决办法： 干热灭菌：耐热器皿，如玻璃制品、研钵、镊子等，
可在180-200℃高温干热灭菌4hr以上；
DNA提取的一般程序
供体细胞培养
收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 总DNA的抽 提、纯化 分离细胞器 细胞器DNA的 分离、纯化
细胞裂解方法 1.化学法 ：
1) 酶解:利用酶在温和的条件下，有选择性地破坏细 胞膜系统。溶菌酶、溶壁酶、纤维素酶、果胶酶等。 2)增溶：利用表面活性剂的增溶作用破坏细胞膜系统。 常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基 三甲基溴化铵(CTAB) 。
线粒体DNA比较
藻类 酵母 植物 动物(扁虫到人) 锥虫 短膜虫 线状 环状 环状 环状 网状 网状 15kb 19-78kb 100-150kb 15-18kb 6000kb(幼体) 30,000kb(幼体)
病毒和噬菌体DNA:主要用于构建基因克隆载体， 可承载较大片段的外源DNA。
质粒DNA:为染色体外遗传物质；分子大小1Kb-几百 Kb不等，具有复制起始位点，可自我复制。主要用于 构建基因克隆载体。
对于基因组文库的构建及Southern杂交，应尽量 使用片段较长的DNA分子。
为了尽可能获得大分子量的DNA，一般采用去污 剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料， 可以辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。 植物总的提取方法从提取原理上主要有以下两种： CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵) SDS法(十二烷基磺酸钠)
poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开
发出许多用于mRNA纯化的层析柱。
28S rRNA 18S rRNA
RNA电泳结果
三、核酸的评价
1.核酸纯度评价：
DNA样品：
OD260/OD280=1.8 较纯；
OD260/OD280>1.8 可能有RNA污染； OD260/OD280<1.8 有蛋白质污染； RNA样品： OD260/OD280=2.0 较纯；
离心除去沉淀后。上清液中的DNA进行反复 抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的DNA。
3.CTAB与SDS
CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂 质，对于含糖较高的材料可优先使用。 SDS法操作简单、温和，也可提取到高分 子量的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。
4.基因组总DNA法提取程序
生物技术专业核心课程
基因工程
3. 基因工程的主要技术及原理
A B C D E
核酸的分离和纯化 核酸电泳 PCR技术 分子杂交技术 DNA核苷酸序列分析
F 基因的化学合成
第一节 核酸的分离和纯化 (Isolation and Purification of nucleic acid) 一、DNA的分离、检测和纯化
核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正
电极方向迁移；
电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成
反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；
1.CTAB法原理
CTAB
CTAB
CTAB
蛋白质
CTAB
高盐溶液(0.7mol/L NaCl)
CTAB
上清液 沉淀
CTAB
CTAB
CTAB
上清液 沉淀
CTAB
核酸 低盐溶液(0.3mol/L NaCl) 乙醇或异丙醇溶液
1.CTAB法原理
CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide,十六烷
再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶于乙醇。
2.SDS法原理
其原理是利用高浓度的SDS（十二烷基硫酸钠 在较高温度（55-650C）条件下裂解细胞，使染 色体离析、蛋白质变性，释放出核酸； 在低温、高盐条件下，使蛋白质及多糖沉淀 (常是加入5mol/L的乙酸钾冰浴，使乙酸钾与
蛋白质及多糖结合成不溶物)。
4.将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液I中， 剧烈振荡；
溶液I：
50mM葡萄糖/25mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；
悬浮菌体
充分悬浮， 避免结块。
5.加入400μl新配置的溶液II，快速颠倒离心
管数次，混匀后，将离心管置于冰上3-5 min；
溶液II： 0.2N NaOH/1% SDS；
8.加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，4℃，
12000r/min离心5min，将上清转至另一离心 管中； 9.加入等体积的氯仿混匀，4℃，12000r/min 离心5min，将上清转至另一离心管中；
进一步变性、沉 淀蛋白质
10.加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀， 置于冰上沉淀DNA； 11.4℃，12000 r/min离心15 min； 12.小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸 上，使所有液体流出； 13.70%乙醇洗涤DNA沉淀；
OD260/OD280>2.0 可能有异硫氰酸残存 ；
OD260/OD280<1.7 有蛋白质或酚污染
2.核酸浓度估算：
当OD260＝1时，
[SSDNA]= 37μg/ml
[dSDNA]= 50μg / ml
[SSRNA]= 40μg / ml
寡核苷酸浓度约为30μg / ml
第二节 核酸的凝胶电泳
质粒DNA电泳结果
1.共价闭合环状超螺旋(covalently closed circular DNA, ccc-DNA) 2.线状DNA(linear DNA, l-DNA) 3.开环螺旋(open circular DNA, oc-DNA)
二、RNA的分离和纯化
一个典型的哺乳动物细胞约含10-5ugRNA，其 中，80-85%为rRNA(28S、18S和5S三种)；其余 15-20%为各种低相对分子量RNA，如tRNA、核内 小分子RNA等，而mRNA只占1-5%。
变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。
（二）RNA的抽提和纯化
1) 酚-异硫氰酸胍抽提法： 异硫氰酸胍(GIT)与b-巯基乙醇共同作用可抑制 RNase活性； GIT与十二烷基肌氨酸钠共同作用可使蛋白质变 性，从而释放RNA；
在酸性条件下，DNA极少发生解离，而是同蛋白
质一起沉淀，RNA则保留在上清液中而得到分离；
裂解细胞膜
沉淀材料残渣
变性、沉淀 蛋白质
静置5min后于4℃、12000 r/min，离
痘病毒
质体
细胞器DNA:主要指线粒体DNA和叶绿体DNA,是真核 生物所特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸 作用和光合作用相关的基因。可用于分离目的基因 和构建克隆载体。
叶绿体DNA比较
双子叶植物 单子叶植物 121（菠菜）-154kb（豌豆） 151（玉米）-182kb（浮萍）
藻类
132（裸藻）-191kb（衣藻）
1.将菌落转接入约5ml含相应抗生素的LB液体 培养基中，37℃恒温振摇，培养过夜(12hr)； 2.取1.5 ml培养物转入微量离心管中，4℃， 12000 r/min离心30 sec，倒掉培养液，尽可 能清除残余液 (可重复2-3次) ； 3. 弃培养液，使细菌尽可能干燥； 菌体的收集 细菌的培养
DNA的来源及用途
染色体DNA:分子巨大，1000Kb-106Kb。 是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料； 也可用于构建染色体载体和染色体基因整合平台。
染色体DNA比较
人 植物 果蝇 酵母 细菌 天花病毒 3x106 kb 2x105~1x108 kb 1.28x105 kb 15,000 kb 3300~4200kb 288 kb 196 kb 几~100以上kb
植物总DNA的提取
一般地说，总DNA主要是指基因组DNA(genomic DNA), 即细胞核内的染色体DNA分子。 核DNA分子呈极不对称的线状结构,一条染色体为一个 DNA分子。高等植物核DNA大约含有10 9 bp，其长度与直 径的比例极不对称，使其对机械力十分敏感。很难分离 出它的完整分子。分离纯化过程中，DNA分子的断裂是 很难避免的。
裂解菌体细胞 控制时间； 操作柔和。
6.加入300μl冰预冷的溶液III，后温和振荡
质粒DNA的分离 中和NaOH； 沉淀蛋白质和 基因组DNA。
10秒钟，混匀后，置于冰上3-5min；
溶液III： 3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸
7.4℃，12000 r/min离心5min，将上清转至 另一离心管中；
2.机械法：
1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌 2)匀浆法：搅切器(blender)，混合器(mixer)，
3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球同时致冷，
在未融熔前用研杵磨成粉末
4)超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行
细胞破碎，效率更高
3.其它方法：
1)煮沸法： 2)冻融法： 3)干燥法：
湿热灭菌：一次性用品，如微量移液吸头(tip)、微 量离心管(eppendorf tube)等，先用0.1%的焦磷酸二 乙酯(DEPC)处理过的水浸泡过夜后，121℃湿热灭菌
30min;
电泳用具：最好专用；用前洗涤剂清洗干净，再用
3%H2O2和0.1%的DEPC水浸泡后，冲洗干净方可使用。 操作者防护：实验过程中必须带手套，并常换手套， 尽量避免外源RNase的污染； 内源RNase：采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质
心10min；
4)将上清液转入另一离心管，加入等体积 氯仿，充分混匀，4℃、12000 r/min，离 心10 min；
进一步变性、沉淀 蛋白质，清除残余 苯酚
沉淀DNA
5)将上清液转入另一离心管，加入等体积 异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰 浴20-30 min，沉淀DNA；
6)挑出絮状DNA沉淀，70%乙醇中洗涤2次； 7)无水乙醇洗涤1次； 8)风干后，加适量TE缓冲液或无菌双蒸水 溶解DNA，-20℃贮存备用。
洗涤、Biblioteka Baidu燥DNA
溶解、保存
DNA电泳结果
大肠杆菌质粒DNA的提取
克隆载体分子及装载于载体中的克隆化 基因，大多是以质粒的形式保存在大肠杆 菌中，因此，许多基因操作都离不开大肠 杆菌质粒DNA的提取，其步骤主要有3个：
细菌的培养 细菌的收集和裂解
质粒DNA的分离和纯化
碱裂解法提取E.coli质粒DNA程序及原理
2) 硅胶膜纯化法： RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与 DNA纯化思路相似； 当含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA 被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开；
在低盐浓度条件下，RNA被洗脱液洗脱下来；
（三）mRNA的纯化
Northern杂交可以使用总RNA,而构建cDNA文库 时，则必须得到纯化的mRNA； 亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3‘端的
沉淀、洗涤DNA 也可用等体 积异丙醇沉淀 质粒DNA；
14.风干后，溶于20-50μlTE缓冲液或无菌 溶解备用 双蒸水中； 适度干燥； 15.加入适量无DNA酶的RNase(20μg/ml)， 消化RNA 37℃处理30min； 16.琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃贮存备用。
开环螺旋 线状分子 超螺旋
基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，能 与核酸形成复合物； 在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，当降 低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时从溶 液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同白 质、多糖类物质分开；
然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，
(Nucleic Acid Gel Electrophoresis)
电泳：带电物质在电场中向相反电极
移动的现象称为电泳。
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，
用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；
优点：
（1）便于分离； （2）便于检测； （3）便于回收。
一、核酸凝胶电泳的基本原理
核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；
mRNA是单链的，极易受到核酸酶的攻击而导致 降解。对RNA的操作要求比DNA更为严格。
（一）控制潜在的RNA酶活性
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒(0-65℃均具活性)；抗变性剂。
2) 解决办法： 干热灭菌：耐热器皿，如玻璃制品、研钵、镊子等，
可在180-200℃高温干热灭菌4hr以上；
DNA提取的一般程序
供体细胞培养
收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 总DNA的抽 提、纯化 分离细胞器 细胞器DNA的 分离、纯化
细胞裂解方法 1.化学法 ：
1) 酶解:利用酶在温和的条件下，有选择性地破坏细 胞膜系统。溶菌酶、溶壁酶、纤维素酶、果胶酶等。 2)增溶：利用表面活性剂的增溶作用破坏细胞膜系统。 常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基 三甲基溴化铵(CTAB) 。
线粒体DNA比较
藻类 酵母 植物 动物(扁虫到人) 锥虫 短膜虫 线状 环状 环状 环状 网状 网状 15kb 19-78kb 100-150kb 15-18kb 6000kb(幼体) 30,000kb(幼体)
病毒和噬菌体DNA:主要用于构建基因克隆载体， 可承载较大片段的外源DNA。
质粒DNA:为染色体外遗传物质；分子大小1Kb-几百 Kb不等，具有复制起始位点，可自我复制。主要用于 构建基因克隆载体。
对于基因组文库的构建及Southern杂交，应尽量 使用片段较长的DNA分子。
为了尽可能获得大分子量的DNA，一般采用去污 剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料， 可以辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。 植物总的提取方法从提取原理上主要有以下两种： CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵) SDS法(十二烷基磺酸钠)
poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开
发出许多用于mRNA纯化的层析柱。
28S rRNA 18S rRNA
RNA电泳结果
三、核酸的评价
1.核酸纯度评价：
DNA样品：
OD260/OD280=1.8 较纯；
OD260/OD280>1.8 可能有RNA污染； OD260/OD280<1.8 有蛋白质污染； RNA样品： OD260/OD280=2.0 较纯；
离心除去沉淀后。上清液中的DNA进行反复 抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的DNA。
3.CTAB与SDS
CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂 质，对于含糖较高的材料可优先使用。 SDS法操作简单、温和，也可提取到高分 子量的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。
4.基因组总DNA法提取程序
生物技术专业核心课程
基因工程
3. 基因工程的主要技术及原理
A B C D E
核酸的分离和纯化 核酸电泳 PCR技术 分子杂交技术 DNA核苷酸序列分析
F 基因的化学合成
第一节 核酸的分离和纯化 (Isolation and Purification of nucleic acid) 一、DNA的分离、检测和纯化
核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正
电极方向迁移；
电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成
反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；
1.CTAB法原理
CTAB
CTAB
CTAB
蛋白质
CTAB
高盐溶液(0.7mol/L NaCl)
CTAB
上清液 沉淀
CTAB
CTAB
CTAB
上清液 沉淀
CTAB
核酸 低盐溶液(0.3mol/L NaCl) 乙醇或异丙醇溶液
1.CTAB法原理
CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide,十六烷
再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶于乙醇。
2.SDS法原理
其原理是利用高浓度的SDS（十二烷基硫酸钠 在较高温度（55-650C）条件下裂解细胞，使染 色体离析、蛋白质变性，释放出核酸； 在低温、高盐条件下，使蛋白质及多糖沉淀 (常是加入5mol/L的乙酸钾冰浴，使乙酸钾与
蛋白质及多糖结合成不溶物)。
4.将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液I中， 剧烈振荡；
溶液I：
50mM葡萄糖/25mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；
悬浮菌体
充分悬浮， 避免结块。
5.加入400μl新配置的溶液II，快速颠倒离心
管数次，混匀后，将离心管置于冰上3-5 min；
溶液II： 0.2N NaOH/1% SDS；
8.加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，4℃，
12000r/min离心5min，将上清转至另一离心 管中； 9.加入等体积的氯仿混匀，4℃，12000r/min 离心5min，将上清转至另一离心管中；
进一步变性、沉 淀蛋白质
10.加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀， 置于冰上沉淀DNA； 11.4℃，12000 r/min离心15 min； 12.小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸 上，使所有液体流出； 13.70%乙醇洗涤DNA沉淀；
OD260/OD280>2.0 可能有异硫氰酸残存 ；
OD260/OD280<1.7 有蛋白质或酚污染
2.核酸浓度估算：
当OD260＝1时，
[SSDNA]= 37μg/ml
[dSDNA]= 50μg / ml
[SSRNA]= 40μg / ml
寡核苷酸浓度约为30μg / ml
第二节 核酸的凝胶电泳
质粒DNA电泳结果
1.共价闭合环状超螺旋(covalently closed circular DNA, ccc-DNA) 2.线状DNA(linear DNA, l-DNA) 3.开环螺旋(open circular DNA, oc-DNA)
二、RNA的分离和纯化
一个典型的哺乳动物细胞约含10-5ugRNA，其 中，80-85%为rRNA(28S、18S和5S三种)；其余 15-20%为各种低相对分子量RNA，如tRNA、核内 小分子RNA等，而mRNA只占1-5%。
变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。
（二）RNA的抽提和纯化
1) 酚-异硫氰酸胍抽提法： 异硫氰酸胍(GIT)与b-巯基乙醇共同作用可抑制 RNase活性； GIT与十二烷基肌氨酸钠共同作用可使蛋白质变 性，从而释放RNA；
在酸性条件下，DNA极少发生解离，而是同蛋白
质一起沉淀，RNA则保留在上清液中而得到分离；