6.植物花药和花粉培养(植物组织培养)

第六章植物花药和花粉培养

第一节单倍体的概念及发生方式

一、植物单倍体的概念

1、单倍体：指具有配子体染色体组的孢子体。或具有配子染色体数的细胞或个体。

二、单倍体的发生方式(4 种)

1、孤雌生殖：由胚囊中未受精的卵细胞发育成胚，进一步发育成单倍体植物。

2、孤雄生殖：在传粉后卵细胞退化消失，由精细胞单性发育成为单倍体植物。

3、无融合生殖：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的单倍体植株。如反足细胞、助细胞等。

4、人工诱发单倍体途径：1966年前: 人工生产单倍体方法，有激素处理、远缘杂交、延迟受粉、用照射花粉授粉。

目前:

⑴离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植物。——花药和花粉的培养

⑵离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成植物体。——胚胎培养

三、雄核的发育途径

1.单核小孢子进行一次均等分裂形成两个等同的子细胞，而不是形成相互不同的营养细胞和生殖细胞，这两个子细胞进一步发育成愈伤组织或胚状体。（pathway I)

2.单核小孢子先进行一次正常的非均等分裂：

1）然后通过营养细胞进一步分裂形成愈伤组织或胚状体（pathway II)

2）营养核退化，而生殖核进一步发育成单倍体植株（pathway III)。

3）两个细胞都参与愈伤组织或胚状体的形成。有些时候两个核融合而导致非单倍体的形成（pathway IV)。

第二节植物花药与花粉培养

一、概念

花药与花粉培养：指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株后使之二倍化的技术。

雄蕊结构：花药是花的雄性器官。包括花丝、花药两部分。其中花药部分由药隔（2n）和花粉粒(1n)组成。花粉粒（也称小孢子）是由花粉母细胞经减数分裂形成。它的染色体数目为体细胞的一半，为单倍体细胞。

花药和花粉培养的基本程序

外植体的选择—外植体（花蕾）预处理—外植体消毒—剥取花药（—分离花粉粒）—接种—诱导培养—分化培养

二、材料选取

1、花粉发育时期的选择

一般情况下，对大多数植物来说，在单核时期（包括单核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。

四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期

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小孢子花粉粒

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花粉培养花药培养

培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进行细胞学花粉发育时期的镜检（醋酸洋红）。(花蕾或幼穗大小、颜色等形态学性状，瓣长/药长比）

2、基因型

供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。二棱大麦比四棱和六棱大麦愈伤组织诱导率高,小麦品种间杂种比纯种更易产生愈伤组织.

3、生理状态的选择

花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高2—3倍。

4、外植体预处理对花粉培养的影响

（1）低温度处理：Nitsch（1973）低温处理可以明显提高花粉胚的诱导率，3℃下保存48h，花粉胚的诱导率提高了33.6%。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药7～9℃下7～14d为宜；水稻处理10℃、48h；小麦和黑麦需在1～3℃下2～20d得到良好效果。

低温处理的作用机理就目前来看有两种观点：一种认为低温可以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，结果使得花粉朝着胚胎方向发育；另一种观点认为低温的作用是使花粉保持了较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。

（2）离心处理Tanaka（1973）将单核后期的烟草花药在10000～11000r/min的速度下离心30min，产生小植株的频率从30.5%提高38.2%，每个花药产生的小植株数目从对照的平均1.6株提高到5.4株。

（3）乙烯处理Bennett和Hughes(1972)在研究小麦化学去雄时注意到，在减数分裂前用乙烯利喷施植株，促使花粉细胞核发生分裂。王敬驹（1979）在培养基中及植株上分别施加乙烯利，小麦花药培养基中较低浓度的乙烯利（40～

80ppm）对花粉的愈伤组织的形成有促进作用。

三、花药和花粉培养技术

1、花药培养

将发育到一定阶段的花药，培养在人工合成的培养基上，使花药内花粉粒的发育途径发生改变，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体或愈伤组织分化成植株。操作程序简单，不需要游离花粉，不需要特殊培养装置。

花药培养产生的花粉植株一般有两条途径：

1）花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株，例如烟草、曼佗罗等。

2）花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导分化植株。

2、花粉培养

从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的技术，又称小孢子培养。

特点:它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，可以获得大量的花粉植株，相当于单细胞培养。1）花粉的分离

分离法：自然散落法(液体培养基培养3-7天,花粉开裂释放小孢子,转移培养)、挤压法、机械游离法（磁力搅拌）。2）花粉培养的方式：

平板培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花粉胚状体，最终分化为植株。

液体浅层培养: 悬浮培养。

双层培养：上-液体+下-固体。

看护培养：花粉-滤纸-固体培养基。

微室培养：在凹形载玻片中悬滴培养。

3）材料消毒

①花蕾用70%的酒精浸泡30秒。

②无菌水清洗。

③无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分。

④放入0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟（也可为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）。

⑤无菌水冲洗3～5次

用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。

4）培养基选择

花药培养培养基有MS、N6、马铃薯培养基、Miller、Nitsch、B5等。不同基因型、花药年龄等所需营养不同。

Nitsch、MS常用于双子叶植物花药培养；N6则用于单子叶植物花药培养。以后研制C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦花药的愈伤组织诱导率。

蔗糖作为培养基能量物质（即碳源）及渗透压调节作用，单子叶植物需要较高浓度蔗糖（5%～15%）；双子叶植物较低（3%左右）。

条件培养基：指预先培养过花药的液体培养基。

四、花粉植株的倍性

1 诱导单倍体植株的倍性

1) 花药培养形成单倍体植株。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。

2）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。黄佩霞（1978）统计2496株水稻花粉植株的染色体数目，其中单倍体占35.3%，二倍体占53.4%，多倍体和非整倍体占5.2%，二种或三种倍性以上混生的植株约占6.1%。

3）激素对倍性变化有很大影响。

通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。

2 单倍体植株的染色体加倍

1）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、富民农、对二氯苯、8-羟基喹啉等。

2）秋水仙素：地中海生长的一种百合科植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质。溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。

（1）小苗浸泡加倍：双子叶植物烟草用0.4%秋水仙素溶液处理48h，加倍率为35%。

（2）顶芽或腋芽处理加倍：将适宜浓度的秋水仙素水溶液，或调和在载体羊毛脂中，处理植株的顶芽或腋芽，诱导其分生组织的加倍。

（3）培养基加倍：用单倍体植株的营养体置于一种适当的培养基上，诱导形成愈伤组织，然后再放到分化培养基上，再生植株。

五、例子：小麦花药培养程序