核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理

法则是利用离心的方式来纯化探针
第三节 核酸分子杂交的方法
• 按待测核酸是否固定在固相支持物上分： • 固相杂交 • southern印迹杂交 • northern印迹杂交 • 斑点杂交 • 原位杂交 • 液相杂交
一、Southern印迹杂交 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
第二节 探针
一、探针的种类
• 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针
基因组DNA探针从基因组DNA中选取某一基因片段 ↓ 与载体连接（质粒、噬菌体） ↓ 克隆(PCR扩增) ↓ 酶切 优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解（与 RNA比较）；③标记方法成熟。
2、变性的方法：
（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
（二）复性 定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱 基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或 杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸 /DNA和寡核苷酸/RNA。
（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶
2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，
大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
cDNA探针（complementary DNA）
通过逆转录 ↓ 双链cDNA ↓S1核酸酶切平两端 加接头 ↓限制酶 优点： 不含内含子及高度 重复序列,但不易获 得 粘性末端 ↓ 载体连接 ↓ 克隆
RNA探针：检测DNA和mRNA
优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本 底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂
核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理 • 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下
按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。
• 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知
核酸序列称探针。
核酸杂交
+
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性
1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的 氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
2.Southern印迹的常用方法
毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中
的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬
四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可
去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将
大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷
酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相
同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此
二、影响杂交的因素
1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜
3. 离子强度：离子强度↑→杂交酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能 降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点：
①低温下探针更稳定； ②能更好地保留非共价结合的核酸。
三、标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成
代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新
合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，
3H-尿苷可掺入到RNA中
体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
（四）Southern印迹
指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程
1、固相支持物的选择 理想的固相支持物应具备的特性 ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
寡核苷酸探针 • 优点：①可根据需要合成相应序列； • ②探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; • ③长 度只有10—50bp，该识别序 列内1 个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。 • ④可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。
二、标记物 （一）理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性
• 不影响碱基配对的特异性
• 不影响探针分子的主要理化性质
• 对酶促反应活性无影响或影响不大
• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
(二) 标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序 的总长度 （2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉