核酸分子杂交技术与应用综述
[说明]核酸分子杂交及PCR技术
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核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
核酸分子杂交与应用
(2)加入所需的限制酶，并在适当条件下温育
(3)加入适量T4DNA聚合酶。
(4)当切除了所需数量的核苷酸后，加入 1μl2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记核苷酸)，37oC保温一小时。
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标记步骤
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加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。
以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作 加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
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随机引物标记法特点
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STEP3
STEP2
STEP1
除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必须采用反转录酶。
标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dNTP掺入到探针DNA链上
操作方便
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3’末端标记
探针的标记
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随机引物法 标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。
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标记步骤
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标记步骤
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取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中
STEP4
STEP3
STEP2
STEP1
影响变性的因素：
影响变性的因素：
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核酸杂交的原理及其应用
核酸杂交的原理及其应用一、核酸杂交的原理核酸杂交是指DNA或RNA的单链与其互补序列的另一条单链通过互补碱基配对结合的过程。
核酸杂交的原理主要包括序列互补性和碱基配对。
1.序列互补性：DNA和RNA分子中的碱基可以通过特定的规则进行互补配对。
DNA的碱基A与RNA的碱基U互补，碱基C与碱基G互补。
这种序列互补性是核酸杂交的基础。
2.碱基配对：核酸杂交的过程中，互补的碱基会通过氢键结合。
DNA双链中的A与T之间形成两个氢键，碱基C与G之间形成三个氢键。
这些氢键的形成增强了双链的稳定性。
二、核酸杂交的应用核酸杂交在生物学和医学领域有广泛的应用。
以下是核酸杂交的主要应有：1.DNA杂交化学（DNA hybridization chemistry）：核酸杂交在DNA的杂交化学中，可以用于DNA的检测和诊断。
通过将DNA探针与待测样本中的目标DNA序列进行杂交，可以检测目标DNA的存在与否。
这种技术可以应用于基因检测，病原体检测，遗传疾病的诊断等方面。
2.Northern blotting：Northern blotting是一种用于检测RNA分子的技术。
在Northern blotting中，通过核酸杂交将RNA分子转移到固定膜上，然后使用标记的DNA或RNA探针与目标RNA序列进行杂交。
通过检测探针的杂交信号，可以确定目标RNA的大小和相对丰度。
这种技术常用于研究基因表达的调控机制。
3.Southern blotting：Southern blotting是一种用于检测DNA分子的技术。
在Southern blotting中，通过核酸杂交检测DNA在凝胶上的分子量和数量。
这种技术常用于DNA重排、基因突变和DNA测序等方面。
4.亚细胞定位：核酸杂交可以用于确定特定DNA或RNA序列在细胞中的位置。
通过将探针标记为荧光染料或放射性同位素，可以使探针在细胞中可见。
这种技术可以用于研究基因的表达和定位。
5.基因组学研究：核酸杂交在基因组学中起着重要的作用。
核酸杂交的常用方法及应用
核酸杂交的常用方法及应用核酸杂交是一种基于互补配对的技术，主要用于研究和分析DNA或RNA的序列、结构和功能。
它是分子生物学和遗传学领域中重要的实验方法之一，具有广泛的应用。
以下将详细介绍核酸杂交的常用方法以及应用领域。
一、核酸杂交的常用方法1. Northern blotting：该技术用于检测和分析RNA的存在和表达水平。
首先，将RNA样本经电泳分离，并转移到固定在膜上的核酸上。
接下来，使用与待测序列互补的探针进行核酸杂交，通过探针与RNA的互补配对形成的杂交物质来检测目标RNA分子。
最后，将膜进行显影和成像，从而获得感兴趣的RNA片段的信息。
2. Southern blotting：该技术用于检测和分析DNA的存在和序列特性。
与Northern blotting相似，该方法也是将DNA样本经过电泳分离后转移到固定在膜上的核酸上。
然后，使用与目标DNA序列互补的探针进行核酸杂交，并通过探针与DNA的互补配对形成的杂交物质来检测目标DNA分子。
3. Fluorescence in situ hybridization (FISH)：该技术是一种高分辨率的细胞遗传学方法，用于检测和定位特定DNA或RNA序列在细胞核中的位置。
这种方法使用标记了荧光染料的探针与待测核酸序列进行杂交，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的分布情况，从而确定目标序列在细胞中的位置。
4. Hybridization chain reaction (HCR)：该技术通过设计一组特定的序列探针，使其形成一个连锁反应，从而实现特定核酸序列的多重扩增。
这种方法可以用于检测特定的DNA或RNA序列，例如基因突变、病原体等，具有高灵敏度和高特异性。
5. DNA microarray：该技术基于DNA杂交原理，可以同时检测上千个DNA 序列。
首先，将多个探针序列固定在特定的载体上，与待测DNA样本进行核酸杂交。
然后通过检测与目标DNA杂交的标记物来确定样本中的目标DNA序列，从而分析样本中大量的DNA信息。
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术定义核酸分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的技术手段。
它利用互补配对的原理，将两个核酸链在一定条件下结合成一个双链分子。
该技术可用于分析、检测、鉴定、筛选和修饰核酸分子等方面，具有重要的实验和临床应用价值。
一、技术原理核酸分子杂交技术的原理是基于核酸互补配对的规律。
核酸是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成的双链分子，两条链通过氢键相互配对形成双螺旋结构。
在核酸分子杂交技术中，将两个互补的核酸链置于一定条件下（如适当的温度、pH值和离子浓度等），使它们形成双链分子。
这个过程中，两个链之间的氢键会断裂，然后重新组合成新的氢键，形成一个更稳定的双链分子。
这个过程被称为“杂交”。
二、应用领域1. 分析基因序列核酸分子杂交技术可用于分析基因序列。
通过与已知序列相比较，可确定未知序列的位置和组成。
这种技术被广泛应用于基因组学和生物技术领域，包括基因定位、基因诊断、基因克隆和基因表达研究等方面。
2. 检测病原体核酸分子杂交技术可用于检测病原体。
该技术可以检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物的存在和数量。
与传统的细菌培养方法相比，核酸分子杂交技术具有更高的灵敏度和特异性，可以更快速和准确地诊断疾病。
3. 鉴定基因型核酸分子杂交技术可用于鉴定基因型。
通过检测DNA序列的变异，可以确定不同基因型之间的差异。
这种技术被广泛应用于疾病的遗传咨询、人类学研究和法医学等领域。
4. 筛选基因库核酸分子杂交技术可用于筛选基因库。
该技术可以通过与探针的杂交来筛选目标基因，从而快速地鉴定和克隆感兴趣的基因。
这种技术被广泛应用于基因工程、药物研发和生物产业等领域。
5. 修饰核酸分子核酸分子杂交技术可用于修饰核酸分子。
通过与修饰剂的杂交，可以将不同的化合物引入到核酸分子中，从而实现对分子结构和性质的调控。
这种技术被广泛应用于药物研发、生物材料和生物传感器等领域。
三、实验步骤核酸分子杂交技术的实验步骤包括样品处理、杂交反应、检测和数据分析等环节。
核酸分子杂交技术与应用综述
核酸分子杂交技术与应用综述摘要核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。
它是基于DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。
分子杂交实验依据其形式的不同可以分为液相杂交、固相杂交、原位杂交，而固相杂交又可以分为菌落杂交、点/狭缝杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。
各类型杂交稻基本原理和步骤是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
关键字核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交应用本文是对分子杂交技术的原理和类型分类及其应用的一篇综述。
旨在了解各种杂交类型的应用方向，即在生物、医学上的应用。
一、核酸分子杂交原理DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。
在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。
加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。
在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度Tm 。
Tm值得大小取决于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其Tm值越高。
因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键。
变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。
根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。
二、核酸分子杂交类型（一）固相杂交固相杂交是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂家探针进行反应，杂交结果可用仪器进行检测，但大多数情况下直接进行放射自显影，然后根据自显影图谱分析杂交结果。
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。
在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。
这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。
作为检测工具用的已知RNA 或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。
它常常用放射性同位素来标记。
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。
而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。
这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。
2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。
比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。
目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。
这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。
常用于在双链DNA上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。
由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。
核酸分子杂交
RNA提取
RNA变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交
RNase 具有活性高，不 易灭活 抑制RNase活 性
所有的试剂和器皿都 必须进去除RNase 处理！！
变性处理：甲醛、乙二醛
破坏RNA二级结构
洗膜
放射自显影或化学显色
基本步骤
1. RNA经变性电泳完毕后，可立即将RNA转 移至硝酸纤维素滤膜上。 2. 将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱 于80℃干燥0.5-2小时。 3. 预杂交，时间为1-2小时。 4. 杂交 过夜 5. 洗膜 6. 用X光片进行放射自显影，附加增感屏于70℃曝光24-48小时。
Northern 杂交与Southern 杂交很相似。主 要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变 性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构， 保证RNA 完全按分子大小分离。
变性电泳主要有3 种:
甲醛变性电泳 乙二醛变性电泳
羟甲基汞变性电泳
电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相 同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上, 然后与探针杂交。
3. 屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物 质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐 减弱的原理，可以设置一定的屏障物来 进行防护。常用的材料有水、砖、大理 石、混凝土、重金属铅等。
32P
有机玻璃版 铅衣
4. 利用衰变：可利用放射性物质存在自发 衰变，其活性随之减少的原理进行外照 射防护。如：半衰期小于15天的放射性 废物，允许放置10个半衰期后作一般废 物处理。
注意事项 1. DNase I的量 2. dNTP a-P 3. 温度4-16℃
Pol I DNase I
两条链都可 被标记
随机引物合成法
核酸分子杂交的种类及应用
核酸分子杂交摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。
也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。
本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。
关键词:核酸分子;分类;应用;1、核酸杂交技术的原理核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。
DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。
DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。
双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。
两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。
核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。
通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。
此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。
核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。
2、固相分子杂交:将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。
固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。
2、1 Southern印迹杂交1975年建立的一种DNA转移方法。
该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。
首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。
核酸杂交技术的原理和应用
核酸杂交技术的原理和应用介绍核酸杂交技术是一种利用互补配对原理来检测和分析核酸序列的重要技术。
它广泛应用于基因组学、遗传学、分子生物学和生物医学等领域。
本文将介绍核酸杂交技术的原理和应用，并通过列点方式详细解释。
核酸杂交技术的原理1.互补配对原理：核酸分子由碱基组成，DNA分子中的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）以及鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之间可以形成互补配对，RNA 分子中的腺嘌呤（A）和尿嘧啶（U）以及鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之间也可以形成互补配对。
核酸杂交技术利用这种互补配对原理，根据核酸序列的互补性进行分析。
2.杂交反应：核酸杂交反应是指两条互补的核酸序列在合适的条件下发生结合。
在适当的盐浓度和温度下，核酸链会解开，使碱基的互补配对能够进行。
通过控制反应条件，可以选择性地使核酸链发生杂交反应，从而检测特定的核酸序列。
3.标记物的应用：核酸杂交技术通常需要使用标记物来检测杂交反应的结果。
常用的标记物包括放射性同位素、荧光染料和酶等。
这些标记物可以与杂交的核酸序列结合，通过测量标记物产生的放射性、荧光或酶活性变化来分析核酸杂交反应的结果。
核酸杂交技术的应用1.基因组学研究：核酸杂交技术在基因组学研究中发挥了重要作用。
通过杂交探针，可以检测到不同组织和生物体中的特定基因表达情况，从而深入研究基因调控网络和功能。
此外，核酸杂交技术还可以用于研究基因组的结构和变异。
2.遗传学分析：核酸杂交技术是遗传学分析的重要工具之一。
通过对不同个体的核酸序列进行杂交反应，可以检测到基因型差异和基因变异等关键信息。
这对于遗传性疾病的诊断和研究具有重要意义。
3.分子生物学研究：核酸杂交技术在分子生物学研究中也得到了广泛应用。
它可以用于检测、定位和分析特定核酸序列，从而揭示细胞和分子水平上的生物学过程。
例如，在研究基因表达调控、蛋白质合成和RNA修饰等方面，核酸杂交技术发挥了重要作用。
4.生物医学应用：核酸杂交技术在生物医学领域也有广泛的应用。
核酸分子杂交技术简介及其应用
班级生物硕01 姓名牛浩学号 20172120470核酸分子杂交技术简介及其应用摘要：本文简要介绍了核酸分子杂交技术的基本概念及其原理，它的杂交类型，包括斑点杂交、细菌的原位杂交技术、Southern吸印杂交和Northern吸印杂交。
探讨了核酸分子杂交技术的研究应用，最后对核酸分子杂交技术做出了相应的研究展望。
关键词：核酸分子杂交技术；概念；原理；杂交类型；研究应用；展望1 基本概念及原理核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化学、分子生物学和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。
也是现阶段定性、定量和定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。
由于其特异性强，灵敏度高、定位准确等优点，目前已被广泛应用于分子生物学、生理学、遗传学、病毒学等基础学科的研究。
DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。
在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。
加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。
在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度T m。
T m值得大小取决于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其T m值越高。
因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键[1]。
变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。
根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。
试论述核酸变性与复性以及分子杂交技术原理在医学领域的应用
试论述核酸变性与复性以及分子杂交技术原理在医学领域的应用以下是我整理的有关于试论述核酸变性与复性以及分子杂交技术原理在医学领域的应用，仅供参考：现代分子生物学是研究生物大分子--核酸及其表达产物蛋白质的结构、功能、遗传、调控、相互关系和相互作用，从分子水平上探讨生命现象的科学，其主要研究对象是核酸（DNA和RNA）和蛋白质。
自从1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构以来，分子生物学在短短五十年时间里以超乎想象的速度飞速发展，渗透到医学每一个领域。
可以毫不夸张的说，如果没有分子生物学的应用，人类探索生命活动的行为将会寸步难行。
将分子生物学技术应用到临床检验诊断学，使疾病诊断深入到基因水平，称为基因诊断。
基因诊断技术主要包括核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）技术、基因多态性分析技术、单链构象多态性（SSCP）分析技术、荧光原位杂交染色体分析（FISH）技术、波谱核型分析（SKY）技术、DNA测序技术、基因芯片技术以及蛋白质组技术等，一些先进的分离和检测技术大大促进了上述技术的完善和发展，如毛细管电泳技术（CE）、液质联用技术（LC/MS/MS）、变性高效液相色谱技术（DHPLC）、非荧光遗传标记分析技术等。
基因诊断在感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤性疾病等的诊断中发挥越来越重要的作用。
下面，我们就临床检验诊断中涉及的主要分子生物学技术作一简要介绍。
1、核酸分子杂交技术即基因探针技术。
利用核酸的变性、复性和碱基互补配对的原理，用已知的探针序列检测样本中是否含有与之配对的核苷酸序列的技术。
是临床应用最早的，也是最基础的分子生物学技术，是印迹杂交、基因芯片等技术的基础。
不少探针已经商品化。
2、PCR技术PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促反应，可以短时间扩增出两段已知序列之间的DNA，用于诊断、鉴定、制备探针及基因工程产品开发等，是一项及其有效和实用的技术。
由于PCR试验存在一定的假阳性和假阴性问题，导致PCR技术在我国临床诊断中的应用曾一度被叫停，近年来由于改进的PCR技术如巢式PCR（nestedPCR）、多重PCR(multiplexPCR)、荧光PCR技术等在较大程度上增加了该技术的敏感性和特异性。
分子杂交技术的原理和应用
分子杂交技术的原理和应用1. 引言分子杂交技术是一种重要的实验室技术，它在分子生物学研究、基因工程以及药物研发等领域得到了广泛应用。
本文将介绍分子杂交技术的原理和应用。
2. 原理分子杂交技术基于互补配对原则，利用单链核酸的碱基序列进行互补配对。
在分子杂交实验中，我们通常使用DNA或RNA进行杂交。
2.1 DNA杂交DNA杂交是一种通过碱基互补配对的技术，它可以用于检测和分离特定的DNA序列。
DNA杂交实验可以分为两类：杂交化合物的制备和杂交温度的确定。
2.1.1 杂交化合物的制备在DNA杂交实验中，我们需要制备含有目标DNA序列的探针。
探针可以使用放射性核苷酸或荧光标记的核苷酸进行标记。
在制备过程中，我们需要提取目标DNA序列，并与探针进行杂交反应。
2.1.2 杂交温度的确定杂交温度是DNA杂交实验中非常重要的参数。
通过控制杂交温度，我们可以选择性地分离目标DNA序列。
一般来说，杂交温度应高于DNA的熔解温度，但低于探针与非特异性DNA序列的杂交温度。
2.2 RNA杂交RNA杂交是一种用于检测和分离特定RNA序列的技术。
与DNA杂交类似，RNA杂交实验也基于碱基互补配对原理进行。
在RNA杂交实验中，常使用荧光标记的核苷酸或荧光标记的探针进行标记。
3. 应用分子杂交技术在多个领域中得到了广泛应用。
以下是几个典型的应用案例：3.1 基因检测和筛选分子杂交技术可以用于检测和筛选特定基因。
通过制备含有目标基因序列的探针，我们可以将探针与待测样品中的DNA或RNA发生杂交反应，从而确定目标基因的存在与否。
3.2 基因表达调控分子杂交技术可以用于研究基因的表达调控。
例如，研究人类疾病的基因调控机制时，可以利用分子杂交技术检测特定基因的表达水平。
3.3 药物研发分子杂交技术在药物研发中也得到了广泛应用。
通过制备含有药物靶标基因的探针，可以使用分子杂交技术来筛选药物候选化合物，从而加快药物研发过程。
3.4 产业应用分子杂交技术在农业和畜牧业中也有重要应用。
简述核酸分子杂交的原理及其应用
简述核酸分子杂交的原理及其应用核酸分子杂交是指两条互补的核酸链通过碱基配对形成稳定的双链结构的过程。
核酸分子杂交的原理是基于核酸序列的互补性。
核酸由四种碱基（腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G和胞嘧啶C）组成，互补碱基对的配对规则是A与T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。
根据这一互补规则，核酸链可以通过碱基配对形成双链结构。
核酸分子杂交的应用主要有以下几个方面：1.分子生物学研究：核酸杂交是分子生物学研究中常用的技术手段之一、通过核酸杂交可以检测目标序列的存在、定位和表达。
例如，可以将标记有荧光等探针的核酸与靶序列杂交，然后通过荧光显微镜观察杂交信号来确定目标序列的位置和表达水平。
2.基因诊断：核酸杂交可以用于诊断病原体感染、遗传性疾病等。
例如，通过核酸杂交可以检测病毒、细菌或寄生虫的核酸序列，从而判断感染情况并确定感染的病原体。
此外，也可以通过核酸杂交检测染色体异常、基因突变等与遗传性疾病相关的DNA变异。
3.基因工程：核酸杂交在基因工程中广泛应用。
一种常见的应用是基因克隆，通过将DNA片段与载体DNA进行杂交，可以将目标基因克隆进入载体中，从而进一步进行基因的表达和功能研究。
此外，核酸杂交也可以用于检测基因表达的调控机制，如通过RNA杂交技术确定RNA的稳定性和降解速率。
4.农业生产：核酸杂交在农业领域有着广泛的应用。
通过核酸杂交技术，可以进行基因型鉴定和遗传背景分析，从而筛选适应性更强、产量更高、病虫害抗性更强的作物品种。
此外，还可以通过核酸杂交技术对转基因作物进行检测，以确保农产品的质量和安全性。
总之，核酸分子杂交是一种重要的实验技术，可以用于核酸序列的检测、基因诊断、基因工程和农业生产等领域。
随着分子生物学和基因工程的发展，核酸分子杂交技术在生命科学研究和应用中的作用将越来越重要。
核酸分子杂交的原理及应用
核酸分子杂交的原理及应用1. 引言核酸分子杂交是一种基于两个互补序列结合的原理，被广泛应用于生物学领域。
本文将介绍核酸分子杂交的原理及其在各个领域的应用。
2. 核酸分子杂交的原理核酸分子杂交是指在适当的条件下，两个互补的核酸序列结合形成双链结构的过程。
核酸分子杂交的原理基于DNA和RNA的互补碱基配对规律，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间形成两个氢键，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间形成三个氢键。
这种特殊的互补配对性使得核酸分子能够在适当的条件下相互识别并结合。
3. 核酸分子杂交的应用核酸分子杂交在生物学研究中有广泛的应用，以下是几个主要的应用领域：3.1 基因组学核酸分子杂交在基因组学中起着重要的作用。
通过核酸分子杂交，可以检测特定基因在细胞中的表达情况。
例如，通过制备荧光探针，能够用核酸分子杂交的方法检测细胞中特定基因的表达水平，进一步了解基因调控网络和疾病发生机制。
3.2 遗传学核酸分子杂交也在遗传学研究中被广泛应用。
通过核酸分子杂交技术，可以检测特定序列在染色体上的位置。
例如，荧光原位杂交（FISH）技术可以用来检测染色体异常和基因缺陷，帮助诊断遗传疾病。
3.3 诊断医学核酸分子杂交在诊断医学中有着重要的应用。
例如，核酸杂交抗体检测（HCA）技术可以用来检测病原体的核酸序列，诊断感染性疾病。
此外，通过核酸分子杂交还可以检测遗传病变、肿瘤突变等，为临床诊断提供依据。
3.4 农业与环境科学在农业和环境科学领域，核酸分子杂交也有广泛的应用。
例如，在农作物改良中，通过核酸分子杂交可以检测转基因植物的特定基因是否被成功导入。
此外，核酸分子杂交还可以用于环境监测，检测特定细菌或污染物的存在。
4. 杂交条件的优化为了获得准确可靠的结果，核酸分子杂交需要在适当的条件下进行。
以下是几个常用的优化条件：•温度：杂交温度是一个关键因素，需要根据所研究的核酸序列进行优化。
•盐浓度：盐浓度可以影响核酸的杂交速度和效果，通常采用适当的盐浓度进行优化。
核酸分子杂交的种类及应用
核酸分子杂交摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。
也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。
本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。
关键词:核酸分子;分类;应用;1、核酸杂交技术的原理核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。
DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。
DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。
双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。
两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。
核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。
通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。
此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。
核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。
2、固相分子杂交:将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。
固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。
2、1 Southern印迹杂交1975年建立的一种DNA转移方法。
该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。
首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术是一种技术，可以用来检测和识别特定的基因，查明个体与被研究物之间的关系。
在过去的几十年里，它已经被广泛应用于疾病诊断、环境检测和发现新基因等领域，基本上都要求快速、灵敏和特异性的检测结果，以及定性和定量的研究结果，而这一切都可以通过核酸分子杂交技术来实现。
本文综述其基本原理、步骤、优缺点以及在医学检验中的应用。
一、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交技术(in situ hybridization, ISH)是一种用来识别和检测特定的基因序列的分子生物学技术，通常用于染色体分析，可以发现特定基因所在的细胞和组织。
它是根据两种相互作用的核酸分子之间结合的原理工作，即“杂交”。
在杂交反应中，一条条的核酸分子（DNA或RNA）互相结合，形成特定的结构，从而在某些非常特异的情况下进行识别。
另外，通过应用适当的荧光技术，可以直观地观察和显示杂交反应。
二、核酸分子杂交技术的步骤核酸分子杂交技术包括以下几个步骤：（1）样本准备。
样本准备是研究时的第一步，在这一步骤中研究者根据自己的研究需求，选择合适的样本。
（2）核酸分离。
在核酸分离步骤中，由于核酸是微小的，因此需要采用特殊的技术来从样本中分离出核酸，而这些技术通常是PCR，即聚合酶链反应，用于提高核酸的灵敏度。
（3）核酸杂交。
在核酸杂交的步骤中，首先，将抗体结合到探针中，然后将探针与样本中的核酸结合起来，形成双螺旋构型，从而实现特异性识别。
（4）信号分析。
在信号分析步骤中，需要对样本中的核酸进行鉴定，以及检测所测试的核酸是否核苷酸序列正确的特定目的。
最常见的技术是利用基因组芯片，通过它们可以对大量的基因进行组合扩增，从而识别、分析和检测出特定基因。
三、核酸分子杂交技术的优缺点（1）优点核酸分子杂交技术有很多优点，如：（1）操作简单，容易实现自动化，可以提高生产效率；（2）能够检测出对特定基因的非常特异性的序列；（3）可以测定大量基因，使得研究者可以更容易地进行基因组学研究；（4）技术可以检测出胞内和蛋白质的体外表达；（5）核酸分子杂交技术的发展使得药物研发有了新的思路和突破，可以更加准确高效地展开新药的研发。
核酸分子杂交课件
变性时间
控制变性时间，确保DNA完全解 离为单链。
温度控制
保持变性温度稳定，避免对DNA造 成损伤。
杂交
杂交液选择
根据实验需求选择合适的 杂交液，以保证杂交反应 的进行。
杂交温度
控制杂交温度，使DNA与 探针进行结合。
杂交时间
确定杂交时间，使探针与 DNA充分结合。
洗脱与检测
洗脱条件
选择合适的洗脱条件，使未结合 的探针被洗去，留下结合的探针。
探针标记
采用高效、稳定的探针标记方法，如荧光染料、 同位素等，确保信号的准确性和可重复性。
样品处理技术的改进
样品纯化
采用高效、快速的样品纯化方法，去除杂质和干扰物质，提高杂 交反应的准确性。
样品预处理
根据杂交目标对样品进行预处理，如变性处理、修复等，以暴露出 目标序列并提高其可及性。
生物素标记
将生物素等标签引入样品中，以便于后续的信号放大和检测。
VS
详细描述
通过核酸分子杂交，可以检测出基因中的 点突变、插入、缺失等变异，用于诊断单 基因遗传病或多基因遗传病，如癌症、糖 尿病等。
生物信息学分析与应用
总结词
核酸分子杂交技术结合生物信息学分析，有 助于揭示基因组学、转录组学和蛋白质组学 的复杂关系。
详细描述
通过核酸分子杂交和生物信息学分析，可以 研究基因组学中的基因重复、转录组学中的 RNA表达模式、蛋白质组学中的蛋白质相 互作用等复杂问题。
基因组测序与注释
总结词
核酸分子杂交技术为基因组测序和注释提供了重要的手段，有助于确定基因的位置和结构。
详细描述
通过核酸分子杂交，可以识别基因组中的重复序列、转座子等复杂结构，为基因组的精细测序和注释提供有力支 持。
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核酸分子杂交技术与应用综述
摘要核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。
它是基
于DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。
分子杂交实验依据其形式的不同可以分为液相杂交、固相杂交、原位杂交，而固相杂交又可以分为菌落杂交、点/狭缝杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。
各类型杂交稻基本原理和步骤是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
关键字核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交应用
本文是对分子杂交技术的原理和类型分类及其应用的一篇综述。
旨在了解各种杂交类型的应用方向，即在生物、医学上的应用。
一、核酸分子杂交原理
DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。
在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。
加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。
在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范
围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度T
m 。
T
m
值得大小取决于核酸分子的G-C含量，
核酸分子的G-C含量越高，其T
m
值越高。
因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键。
变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。
根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。
二、核酸分子杂交类型
（一）固相杂交
固相杂交是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂家探针进行反应，杂交结果可用仪器进行检测，但大多数情况下直接进行放射自显影，然后根据自显影图谱分析杂交结果。
1、菌落杂交
用于重组细菌克隆筛选的固相杂交，称作菌落杂交。
主要步骤包括菌落平板培养、滤膜灭菌后放到细菌平板上，使菌落粘附到滤膜上，将滤膜放到经适当溶液饱和度吸水纸上，菌斑溶解产生单链的DNA，固定DNA用32P标记的单链探针与菌落DNA进行杂交。
杂交后，洗脱未结合的探针，将滤膜暴露于X线胶片进行放射自显影。
将自显影胶片、滤膜、培养平板比较就可以确定阳性菌落。
2、Southern杂交
Southern杂交是从环境样品中提取细菌总DNA，用适当的限制性核酸内切酶切割，经凝胶电泳分离后，将凝胶中的条带转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后对该膜进行探针检测的方法。
只有含有靶DNA序列的DNA分子才能与特定的核酸探针进行杂交。
Southern杂交主要用于研究某些细菌多态性变化规律。
3、Northern印记杂交
Northern印记杂交和Southern印记杂交的过程基本相同，区别在于靶核酸是RNA而非DNA。
RNA在电泳前已经变性，进一步经历变性凝胶电泳分离后，不再进行变性处理。
在Northern杂交中所使用的探针常常是克隆的基因。
（二）液相杂交
液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型。
液相杂交的反应原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应，然后利用羟磷灰石柱选择性结合单链或双链核酸的性质分离杂化双链和未参加反应的探针，用仪器计数并通过计数分析杂交结果，或者利用核酸分子的减色性（260nm处吸光度的降低与双链形成去的多少成正比）分析杂交的结果。
（三）原位杂交
原位杂交是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。
其中在此技术上发展的荧光原位杂交（FISH）技术因其经济、安全、无污染、探针稳定、快速、简便、直观、可靠、灵敏度高、信号强、背景低等，在诊断生物学、发育生物学、细胞生物学、遗传学和病理学研究上均得到广泛的应用。
三、核酸分子杂交技术应用
（1）Southern印记杂交
1、单基因遗传病的基因诊断：早在1978年，简悦威等医学家在镰状细胞贫血症的基因诊断
中就采用过Southern杂交的方法，取得了基因诊断的突破。
2、基因点突变的检测：例如ATP敏感性钾离子通道的亚单位内向整流钾通道基因A635G突
变的检测
（2）Northern印记杂交
Northern印记技术多用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录以及转录的相对水平。
目前，Northern印记技术仍然被认为是检测基因表达水平的金标准。
（3）液相杂交
以液相杂交技术为基本工作原理设计的多功能悬浮点阵仪是液态芯片技术应用的典范。
这一技术平台已被应用于遗传突变的分子诊断，如出生缺陷干预工程中的Down’s综合征、珠蛋白合成障碍性贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷的基因诊断，也已被用于SNPs分析、感染性疾病的鉴别诊断、药物敏感性和亲子鉴定。
此外，还可以应用于基因表达谱的分析，从而进行肿瘤性疾病如血液病、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌和结肠癌的分子病理学研究。
（4）荧光原位杂交(FISH)技术
1、细胞遗传学分析
①产前诊断：在新生儿的先天性疾病中，染色体的数目异常
要占很大的一部分，其中以染色体X、Y、13、18和21数量
的异常最为多见。
利用FISH技术的优势还可以用于产前诊断
中的羊水细胞核型分析。
常规的染色体型分析技术需要对羊
水细胞进行培养，时间较长。
FISH技术可以在少量的羊水细
胞涂片上进行异常染色体的数目分析，不需要羊水细胞的培
养，记得地缩短了病人等待的时间。
②生殖医学中的应用：采用FISH技术可对一个卵裂球的染色
体进行检测，排除存在染色体异常的胚胎，提高胚胎种植成
功率。
另一方面，对精子染色体的研究已经成为男性不育者
精子检测的一项重要内容。
③血液疾病中染色体易位的检测：在化疗后缓解的慢性粒细
胞性白血病病人的标本中，采用FISH技术极易发现残存的白
血病细胞，确定微小残留病灶。
FISH检测的结果对白血病的
诊断、治疗和预后的估计提供了有力的依据，也为白血病机
制的研究提供了线索。
2、病原学检测：采用FISH技术还可以快速鉴定血培养中的微生物、送检样本中的病毒等，采用诊断微生物DNA或RNA的荧光标记探针可以直接快速地检测出微生物病原体核酸，检测灵敏度较高。
3、比较基因组杂交
4、基因图谱绘制
5、诊断微生物菌落结构与群落动态
6、监测微生物的原位生理学
7、FISH技术结合流式细胞术定量化检测微生物
四、展望
尽管核酸分子杂交技术的应用越来越广泛，但其在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大；第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA探针实验做到简便、快速、低廉和安全。
参考文献
[1] 樊绮诗，吕建新主编《分子生物学检验技术》[M] 2007
[2] 傅桂莲主编《分子生物学检验技术》[M] 2003
[3] 赵开弘主编《环境微生物学》[M] 2009。