黑曲霉产纤维素酶液体发酵

工艺优化和控制

纤维素酶是生物降解含β-1,4 糖苷键的纤维素生成葡萄糖的一类复合酶的总称。纤维素酶也是具有纤维素降解能力酶的总称，纤维素酶系包括3 种水解酶，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，只有各组分酶共同作用才能将纤维素彻底水解为葡萄糖[1-2]。纤维素酶已经广泛应用于酿造果汁与蔬菜加工，粮食工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分的提取，以及纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面[3-8]。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于丝状真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中曲霉是公认产纤维素酶最高的菌种之一[9]。而黑曲霉是公认安全(GRAS)的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生长快、发酵周期短，具有明显的优越性，可望用于食品和医药等领域。植物纤维是再生的生物资源，笔者是以植物纤维为碳源，对黑曲霉（A. niger）生产纤维素酶条件进行研究，为利用植物纤维素工业化生产纤维素酶提供技术参数。故希望通过对黑曲霉A3 产纤维素酶的液体发酵产酶条件的优化，以获得酶的高产量，为纤维素酶的生产应用奠定基础。

1．材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉A3(Aspergillus niger A3)：当地采取。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 营养盐液Mandels 氏营养盐液[3]，再加入NaNO3 4.0 g/L。

1.2.2 斜面培养基(1)菌种保藏培养基(g/L)：麸皮5，蛋白胨1，琼脂20，用

营养盐液配制；(2)产孢子培养基：PDA 培养基。

1.2.3 发酵产酶基础培养基产纤维素酶基础培养基(g/L)[4]：玉米芯80，用改良Mandels 氏营养盐液配制，250 mL 三角瓶30 mL 装液量，起始pH5.5～6.0。

上述所有培养基均在1.0×105 Pa、121 ℃灭菌30 min。

1.2.4 斜面培养将接种后的斜面于28 ℃培养4～5 d。

1.2.5 摇瓶发酵产酶培养将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制备成孢子悬

液，接种3 mL(1.2×108 个孢子)到发酵培养基中，于28 ℃、200 r/min 振荡

培养。

1.3 测试及计算方法

1.3.1 酶活力的测定方法CM-纤维素酶活力的测定：取适当稀释的粗酶液0.1 mL，加到1 mL、1%的羧甲基纤维素钠悬浮液中(pH4.6，0.2 mol/L醋酸缓冲液配制)于50 ℃水浴反应10 min，用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法，测定产生的还原糖。以木葡萄糖为标准，在本实验条件下，每min 产生1 μmol 还原糖所需的酶[5-6]。定义为1 个酶活力单位(IU/mL)。

1.3.2 pH 值的测定采用国产精密pH 试纸和pHs-25 型酸度计。

2 结果

2.1 产纤维素酶发酵特性研究

为了对黑曲霉产纤维素酶的发酵条件进行研究，首先对其发酵产纤维素酶的特性进行了考察。实验按25 g/L 的浓度加入麦秸粉、甘蔗渣和玉米芯等不同碳源，用营养盐液配制250 mL 三角瓶装液量30 mL，在28 ℃、200 r/min 振荡培养，每隔24 h 取样测定纤维素酶的活力，见表1。

表1 黑曲霉A3 产纤维素酶发酵时间与酶活的关系

碳源(25 g/L)不同发酵时间的相对酶活力/%

24 48 72 96 120

玉米芯

甘蔗渣

麦秸粉

2.2 碳源浓度对产纤维素酶的影响

[1] 林风.纤维素酶的生物化学和分子生物学的研究新进展.生命科学,1994,6(1):18-31.

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[9] Beguin P. Molecular biology of cellulose degradation. Annu Rev

Microbiol, 1990, 44:219-248.

土壤纤维素酶测定方法

纤维素酶一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂：试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。二、仪器设备恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶三、操作步骤取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白：无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。四、结果计算土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；

米曲霉的制备

毕业论文课题名称米曲霉的制备姓名学号所在系制药与生物工程系专业年级P09生物制药指导教师职称讲师指导教师职称二O 一二年六月八日

摘要微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养

目录引言 (1) 1 菌种的种类 (1) 1.1 米曲霉 (1) 1.2 黑曲霉 (1) 2 菌种的选择条件 (1) 2.1 不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素 (1) 2.2 酶系全、酶活力高 (2) 2.3 对环境适应能力强，生长繁殖快 (2) 2.4 酿制的酱油风味好 (2) 3试管实验 (2) 3.1 灭菌 (2) 3.2 培养基的制备 (2) 3.3 培养基的鉴别 (2) 3.4 接种培养 (3) 3.5 菌种的留选 (3) 4 锥形瓶培养 (3) 4.1 原料配比 (3) 4.2 接种培养 (3) 5种曲制备 (3) 5.1 种曲原料要求 (3) 5.2 做料前检查事项 (4) 5.3 做料 (4) 5.4 蒸料 (4) 5.5 抽真空 (4) 5.6 降温 (4) 5.7 接种 (5) 5.8 自动培养 (5)

高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育

湖北农业科学2009年（责任编辑郑威） mineral forming elements ［C ］．Amsterdam ：Elsevier ，1979． 253－292．［6］ NEALSON K H．The microbial manganese cycle ［A ］． KRUMBEIN W E．Microbial geochemistry ［C ］．Oxford ：Blackwell Scientific Publications ，1983．191－221．［7］ TEBO B M ，BARGAR J R ，CLEMENT B G ，et al．Bio-genic manganese oxides ：properties and mechanisms of forma-tion ［J ］．Annu．Rev．Eath．Planet Sci ，2004，32：287－328．［8］田美娟，邵宗泽．深海抗锰细菌的分离鉴定［J ］．厦门大学学报（自然科学版），2006，45（2）：272－276．［9］ SOLOMON E I ，SUNDARAM U M ，MACHONKIN T E．Multicopper oxidases and oxygenases ［J ］． Chem Rev ， 1996，96：2563－2605．［10］ TONER B ，FAKRA S ，VILLALOBOS M ，et al．Spatially Resolved Characterization of Biogenic Manganese Oxide Pro-duction within a Bacterial Biofilm ［J ］．Appl Environ Micro-biol ，2005，71（3）：1300－1310．第48卷第1期 2009年1月湖北农业科学 H ubei A gricultural S ciences Vol．48No.1 Jan ．，2009 收稿日期：2008－10－18 基金项目：鲁东大学基金项目（20053305）作者简介：冯培勇（1977－），男，山东日照人，硕士，主要从事微生物产酶的研究工作，（电话）132********（电子信箱）fengpeiyong2004＠yahoo．com．cn 。纤维素是广泛存在于自然界中的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质，可被存在于微生物中的纤维素酶所降解。纤维素酶指的是降解纤维素酶生成葡萄糖的一组酶的总称。目前认为，完全降解纤维素至少需要3种功能不同且互补的纤维素酶组分，即内切葡聚糖酶（C1酶或EG ）、外切葡聚糖酶（Cx 酶或CBH ）、β－葡萄糖苷酶（简称βG ）［1］。纤维素酶的应用随着工业的发展而日趋广泛，不仅能用于生产葡萄糖、酿酒、饲料工业、纺织行业、环卫污物的处理、农产品加工及生物工程等方面［2］，而且可用于服装加工行业［3］。由于野生型菌种的纤维素酶活力不高，因此，利用各种诱变手段选育高产纤维素酶生产菌一直是国内外研究的热点。本研究通过化学诱变剂NTG 、硫酸二乙酯和LiCl 对一株黑曲霉菌株进诱变，获得了纤维素酶活性显著提高且遗传性状稳定的突变株。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger F1），本实验室分离保存。 1．1．2 培养基 ①斜面培养基（PDA 培养基）：马铃高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育冯培勇，宿红艳，张丽，王艳华（鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025）摘要：以1株黑曲霉（Aspergillus niger F1）为出发菌株，经过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂诱变处理，选育出1株纤维素酶高产菌株L1。在适宜条件下，其产CMCase 活力为出发菌株的150．2％。关键词：纤维素酶；化学诱变；黑曲霉中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）01－0088-03 Breeding of High-Yield Cellulase Aspergillus niger Mutated by Chemicals FENG Pei－yong ，SU Hong－yan ，ZHANG li ，WANG Yan－hua （College of Life Science ，Ludong University Yantai 264025，Shandong ，China ） Abstract ：A strain ，Aspergillus niger F1，was used as starting strain and mutated by NTG ，DES and LiCl．The strain named L1was bred which could produce high－yield cellulase．Under suitable conditions ，its CMCase activity was 150．2％of the starting strain． Key words ：cellulase ；chemical mutatation ；Aspergillus niger !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

黑曲霉发酵生产α-淀粉酶微生物实验报告

黑曲霉发酵生产α-淀粉酶前言： α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。自从日本研究者Y asujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。正文：一、实验目的 1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法二、实验原理 1.蒸汽系统：蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。 2.温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 (3) 发酵过程自动控温系统 3.空气系统：空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐 4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。 5.在线控制系统

黑曲霉生产纤维素酶工艺设计

黑曲霉生产纤维素酶工艺设计 1. 维素酶 1.1 纤维素酶的组分纤维素酶是水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系。纤维素酶是起协同作用的多组分酶系，国内外多数根据纤维素酶的底物及作用的位点和释放的产物将其分为三类:（1）葡聚糖内切酶(endo-l，4-D-glueanase，EC3.2.1.4)来自真菌的简称EG，又称CMC一Na酶;来自细菌的简称Lne)。这类酶不能水解结晶纤维素如棉花和微晶纤维素等，主要作用于纤维素内部的非结晶区和一些可溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，随机降解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素、纤维二糖和葡萄糖, 其分子量大小约23-146KD。(2) 葡聚糖外切酶(exo-1，4-β-D-glucanase，来自真菌简称CBH;来自细菌简称Cex)。作用于纤维素线状分子末端，分解1，4-β-D糖苷键，每次从底物的非还原端切下一个纤维二糖分子，故又称纤维二糖水解酶，可以水解无定形纤维素和微晶纤维素，对棉花有微弱的作用分子量约38-118KD。(3)β-葡萄糖苷酶(β-D一glucosidase，简称BG)纤维素大分子首先在GE酶和CBH酶的作用下降解为纤维二糖，再由BG酶水解成二个葡萄糖分子。其分子量约为76KD。 1.2纤维素酶的作用机制目前对纤维素酶的分子机制大致有3种假说:改进的Cl一Cx假说、顺序作用假说和竞争吸收模型。它们都认为，纤维素酶降解纤维素时，先吸附到纤维素表面，然后其中的内切酶在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，外切酶从葡聚糖链的还原或非还原端进行水解产生纤维二糖，β-葡萄糖苷酶水解纤维素二糖为葡萄糖。在纤维素溶解糖化过程中内切酶和外切酶的比值会显著地影响纤维素溶解活力，而且在纤维素糖化过程中β-葡萄糖普酶组分的加入会使这种协同作用大大加强[1]，应该注意的是，这种协同作用不仅作用顺序不是绝对的，而且各酶的功能也不是简单、固定的。研究表明，GE和CHB都能引起纤维素的分散和脱纤维化(沿纤维素的经度轴方向分层，形成更薄更细的亚纤维)，这样纤维素的结晶结构被打乱，导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，

黑曲霉液体发酵制备_葡萄糖苷酶的研究_刘敏

第42卷第5期2008年9月生物质化学工程B iomass Che m ical Eng i n eering V o.l 42N o .5Sep .2008 黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究收稿日期:2008-02-20 基金项目:国家自然科学基金(30471361),江苏省高校自然科学重大基础研究项目(06KJ A22015) 作者简介:刘敏(1981-),女,江苏徐州人,硕士生,主要从事生物质资源生物降解与转化的研究 *通讯作者:勇强,教授,博士生导师,主要从事生物质资源生物降解与转化和制浆造纸生物技术研究。刘敏,欧阳嘉,勇强* ,余世袁 (南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037) 摘要:研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉B -葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以40g /L 麸皮为碳源,在250mL 三角瓶中装液40mL,接种量8%,初始p H 值5.5,30e 、170r /m in 下培养10d ,B -葡萄糖苷酶活力为19.12I U /mL 。B -葡萄糖苷酶最适温度为65e ,40e 时稳定性较好;最适p H 值为4.8,在p H 值3.0~5.0之间稳定性较好。关键词:黑曲霉;B -葡萄糖苷酶;麸皮中图分类号:TQ91;Q 55 文献标识码:A 文章编号:1673-5854(2008)05-0005-04 Preparati on of B -G l ucosi dase by A s p er gillus ni ger i n Sub merged Fer m entati on L IU M i n ,OUYANG-Jia ,YONG Q iang ,YU Sh-i yuan (Co ll ege of Chem ical Eng i neeri ng ,N anji ng F orestry U niversity ,N anji ng 210037,Ch i na) Abstrac t :The effects o f culture cond iti on on B -g lucosidase prepara ti on by A sp ergillus ni ger i n sub m erged fer m en tati on and the apparen t enzym ati c properties of B -g l ucosi dase we re i nvestigated .W heat bran w as the opti m a l i nducer o f B -g l ucosi dase a m ong tested carbon sources .T he opti m al culture cond iti on o f B -g l ucosi dase preparati on by A.n i ger i n subme rged fer m entati on w as 40mL m edi u m i n 250mL shake fl ask ,the i nocu lati on w as 8%,the i nitial p H value w as 5.5,t he culture te m perature and rota -ti on speed of Incuba t o r Shaker w ere 30e and 170r /m in ,respecti ve l y ,and the h i ghest B -g lucosidase acti v ity of 19.12I U /mL w as ob tained for 10days culti v ati on .The opti m a l te m perature and p H va l ue o f B -g l uco si dase reac ti on w as 65e and 4.8,respec -ti ve l y .The B -g l ucos i dase was stab l e unde r 40e and i n t he env iron m ent p H value o f 3.0-5.0. K ey word s :A spergilli us ni ger ;B -g lucosidase ;wheat bran B -葡萄糖苷酶(E C 3.2.1.21)是纤维素酶系的主要组分,其在纤维素水解过程中的作用是将纤维素经内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)作用产生的纤维低聚糖和纤维二糖水解成葡萄糖[1] 。除了纤维素糖化外,B -葡萄糖苷酶还广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织、造纸和农业等领域[2] 。虽然自然界中大多数能够分泌纤维素酶的微生物也能合成B -葡萄糖苷酶,但不同的微生物合成B -葡萄糖苷酶的能力有差异。黑曲霉(A s pergillus niger )是较好的B -葡萄糖苷酶生产菌株,本文作者研究了培养条件对黑曲霉NL02液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。 1 实验 1.1 菌种黑曲霉(A s p ergillus ni g er )NL02,由南京林业大学生物化工研究所保藏。1.2 材料麸皮,收集于江苏省徐州市,粉碎至0.20~0.28mm;玉米芯、玉米秸秆,收集于江苏省盐城市,粉碎至0.20~0.28mm;硫酸盐纸浆,南京林业大学制浆造纸工程研究所提供;羧甲基纤维素,由上海国药集团提供。1.3 培养基斜面培养基:PDA 培养基。种子培养基:

黑曲霉的次级产物的提纯

淮北师范大学信息学院 07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔

利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤：筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化一、菌种的筛选： 1、土壤采样：采样人：万纹纹王磊陈晨夏柱宝采样时间：采样地点：环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。 2、倒平板：将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。 PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然 3、制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、3 10-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。

4、涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上4 10-、5 10-和6 10-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由4 10-、5 10-和6 10-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。 5、培养：将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d. 6、挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。用灭菌后的接种环在单个菌落上挑取少许要分离的细胞，接种到PDA 培养基的斜面上。置于35℃的培养箱中培养，待菌苔长出后观察其特征是否一致。 7、划线分离：用灭菌后的接种环挑取斜面培养基上的菌落在培养皿中划线。此步需要9 个培养皿。（注意：接种的过程最好在接种箱内进行。）将已划线的培养皿置于35℃的培养箱中培养3-5d 。观察菌落特征是否一致。 8、镜检：在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液；仪器用具：无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，50%乙醇及显微镜等） 9、制备母斜面：用灭菌的接种环将三种划线平板中的纯种黑曲霉接种到斜面上，作为母斜面，35℃培养，备用。 10、产酸能力的检测：将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入斜面孢子2环，于30~33℃培养。旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120

发酵生产纤维素酶研究进展

发酵生产纤维素酶研究进展摘要：纤维素酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等领域。纤维素酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。综述了纤维素酶的种类、高产纤维素酶菌种选育、发酵类型与优化等方面的研究进展，并展望了纤维素酶发酵生产的研究方向及前景。关键词：发酵纤维素酶液体发酵固体发酵优化纤维素原料是地球上分布广泛且含量丰富的可再生资源，其生物合成和降解过程是自然界中碳循环的中心环节。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。随着纤维素资源越来越受到人们的重视，其能量密度低，难降解等特性却阻碍了其开发利用的进程。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它的作用是将纤维素转化为糖类，能够降解细胞壁，使细胞内溶物释放。作为重要的工业用酶，纤维素酶广泛应用于在能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等诸多领域。 1977年，Elwyn T. Reese 发现木霉属中的菌株具有分泌纤维素酶的能力，并将该具有分泌纤维素酶能力的菌株命名为里氏木霉（Trichoderma reese ），该发现为工业大规模发酵生产纤维素酶奠定了基础。纤维素酶广泛存在广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，其中真菌纤维素酶种类最多，最易获得和用于大规模生产，且具有较稳定的pH 、温度适应性，因此是工业用纤维素酶的重要来源。目前应用最广的纤维素酶生产菌是里氏木霉，也有曲霉属（Aspergillus ）、青霉属（Penicillium ）的菌种。自20世纪50年代首次发现以来，便得到广泛的研究与应用。近几年来，真菌纤维素酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺条件优化、发酵工艺放大和酶的分离纯化等方面。 1 纤维素酶的种类纤维素酶(cellulase)指的是降解纤维素的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系。包括内切 1，4-葡聚糖酶（C 酶），外切葡聚糖酶（C 酶）和β-葡萄糖苷酶（C 酶）。 X 1B 作用方式如下图：

羧甲基纤维素酶测定原理

纤维素酶活力的测定一、目的学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。二、原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料（1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份× 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份× 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器（1）722 型或其他型号的可见分光光度计（2）恒温水浴2 台（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）万分之一分析天平（7）恒温干燥箱（8）冰箱（9）试管架（10）胶头滴管（11）具塞刻度试管20mL×24 （12）移液管或加液器0.5 mL×3；2mL×7 （13）容量瓶100 mL×6；1000 mL×3 （14）量筒50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1 （15）烧杯100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1 3．试剂（均为分析纯）

（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。（3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O （MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

米曲霉的介绍

1.菌种特点：米曲霉( 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。米曲霉米曲霉是一类产的，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、、、等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链降解为糊精及各种低分子糖类，如、等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为、及各种，而且可以使辅料中、等难吸收的物质，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于、、生产曲酸、等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产不能表达的真核生物活性蛋白的。米曲霉所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病

年产300吨纤维素酶工厂的初步设计_毕业设计

年产300吨纤维素酶工厂的初步设计摘要

纤维素是年产量巨大的可再生性资源，地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中，纤维素占了近一半。目前，自然界中纤维素只有一小部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还会造成环境污染。利用这一年产量巨大的可再生性资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。本设计采用目前认为是最好的产纤维素酶的菌种里氏木霉作为发酵菌种，液体深层发酵过程中采用变温发酵的方法分别控制菌种的生长和产酶，提取过程中采用超滤、层析等，提高产品的收率。最后采用喷雾干燥做成固态的酶制剂。本设计的主要内容有：工厂总平面布置、全厂工艺流程设计、工艺计算、设备的计算与选型、成本核算；另外，完成设计图纸8张，有工厂总平面布置图、工艺流程图（3张）、发酵罐设计图、种子罐设计图、发酵车间设备布置图（平面图和立面图）。根据全厂工艺设计和计算结果可以看出，该设计能够达到工业生产的要求。关键词：纤维素酶；液体深层发酵；里氏木霉

ABSTRACT Cellulose is a kind of reproducible resource of great output, it takes about a half of the hundred million biomaterial making by photosynthesis. Presently, only a few cellulose are utilized, most of cellulose are wasted and pollute environment. It is of great importance to transfer these resource to energy ,food, and so on. This design adopt Trichoderma reesei which produce cellulase best. During the liquid submerged fermentation course we chang the temperature in order to control the growth that germ grows and produce cellulase respectively. Ultrafiltration and chromatography are used In the extrace process for improve the yield. In the end we make solid zymin by spray dring . The design mainly include the contents hereinafter: the layout of the whole factory ,the craft argumentation of the whole factory，the calculation of the craft，the calculation and type choosing of main equipments, the calculation of the costs. And design 8 charts , that are the layout of the whole factory, the design of the craft process(3), the design of the fermentation pot, the design of seeding tank, the lay out for equipments of the fermentation workplace(ichnography and space).According to the craft argumentation of the whole factory and the result of the calculation, the design can come up to the request of industrialization. Keywords: Cellulase; liquid submerged fermentation;; Trichoderma reesei

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板

本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级： 2016年3月

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株

目录第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)

米曲霉

1.菌种特点：米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。米曲霉米曲霉米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵

纤维素酶固体发酵工艺的改良研究

纤维素酶固体发酵工艺的改良研究（生命科学学院，生物技术专业黄泽锦）（学号：2000302063）摘要：纤维素酶的固体发酵对发酵培养基的要求是很严格的，如培养基灭菌，无菌操作的等等，都是限制纤维素酶应用于生产的一个重要原因。本实验通过一种对细菌抑制效果强，但对霉菌抑制能力一般的抑制剂对发酵过程进行控制，运用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）来测定羧甲基纤维素酶活（CMCase）及滤纸糖酶活（FPA,FPase）。探讨是否能够实现在培养基未灭菌或者在有菌操作下实现纤维素酶的固体发酵，简化实验对培养基和操作过程的操作要求，进而为纤维素酶的工业化生产提供一定实验依据。关键词：纤维素酶，抑菌剂，CMCase，Fpase，酶活力教师点评：本论文应用了自制的抑菌剂于纤维系酶的固体发酶工艺中，有一定抑制细菌的能力，但又不影响霉菌的产纤维素酶的活性，为简化固体发酵工艺探索了一条新的途径，有一定的实用参考价值。（点评教师：余少文，副教授）一．前言纤维素占全球植物总干重的30%—50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物[1]，但是，纤维素分子是由葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，每个大分子中含的葡萄糖残基数一般为8000--12000个。天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成，其结晶度一般在30%—80%之间。在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维丝，包埋在半纤维素和木质素里，形成网状结构。纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55x109t，其中有89%尚未被利用或未被合理利用（如直接焚烧）目前全世界被开发利用的农林纤维副产物不足2%，我国约有50%以上的农林废弃物在田间地头被白白烧掉。全世界每年因农林废弃物焚烧不仅造成直接的经济损失达数十亿元，而且由于焚烧而产生的滚滚浓烟及排放的大量有害气体严重影响了公路、航空的安全，污染了环境，对气候、生态等也造成了严重的影响。而同时在另一方面，世界上还有十多亿人口由于粮食不足而遭受饥饿、营养不良。灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁；随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题；由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略已在世界各国逐步展开。植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。经过多年的实验研究，虽然取得不上成果，但是实验的成本却总是居高不下，使得实验成果不能很好的应用到生产中，本实验通过研究抑菌剂对霉菌的影响，实现的对实验要求的降低。本测试方法对纤维素工业应用中，对控制生产过程、产品质量及降低成本具有一定的实际指导意义。 1.1. 纤维素酶的概述 1.1.1 纤维素酶的组分：一个完整的纤维素酶系，通常由作用方式不同而能相互协同催化水解纤维素的三类酶组成，即(1)内切葡萄糖苷酶(endo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．4，简称EG、Cx)。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β—1，4—糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。(2)外切葡萄糖苷酶(exo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．91，C1)，又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)。这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β—1，4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。 (3) β—葡萄糖苷酶(β—glucosidase，EC3．2．1．21，简称BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

纤维素酶的检测方法

纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作： 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作