巴斯德毕赤酵母表达系统
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
6、使用方便、简单，而且成本较低
第5页/共19页
结构特点
一、单细胞微生物 1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养 2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、
折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量 的蛋白
第6页/共19页
二、微体（也称过氧化物酶体）
1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降 解，亦不会对细胞产生毒害
2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的 第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在 AOX催化下产的H202对细胞的毒害。
第7页/共19页
醇氧化酶（AOX）
甲醇 AOX
甲醛 H2O2
微体 细胞
第8页/共19页
毕赤酵母质粒载体
第9页/共19页
几个概念
• 同源基因重组 ：同源染 色体的非姐妹染色单体的 交叉互换引起的互换重组
第18页/共19页
谢谢大家！！
第19页/共19页
第2页/共19页
• 80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵 母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化 酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株， 开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。
• 1993年Philips pertoleum公司委托Invrtigone公 司代理毕赤酵母表达系统的产品。
第1页/共19页
起源及背景
• 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是8O年 代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
• 30年前Koichi Ogata首次发现有些酵母可以利用 甲醇为唯一的碳源和能源.
• 70年代Philips pertoleum公司就开发出高密度连 续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。
第15页/共19页
发酵过程
一般分为三个阶段： ①成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌
量，该阶段一般采取分批补料的方式进行； ②过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳
源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏； ③诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中
流加甲醇诱导重组蛋白的表达。
第3页/共19页
毕赤酵母与其它表达系统相比 有许多优点
1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度 生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从 而进行高效表达
2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构 稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合 到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株
3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基 因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达
• 穿梭质粒：是指人工构建的 具有两种不同复制起点和选 择标记，可在两种不同类群 宿主中存活和复制的质粒载体。
第10页/共19页
pPIC9k质粒图谱
• AOX--醇氧化酶 • S --- 分泌信号
• MCS –多克隆位点 • TT---终止信号
• HIS4--组氨醇脱氢酶 • Kanamycin---抗卡拉霉素基因 • pBR322---大肠杆菌的复制起始位点 • Ampicillin---抗氨苄青霉素基因
第16页/共19页
应用举例
依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具 有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白
Exenatide
Twice a day
2.4h被代谢
Exenatide
HSA
PCR 基因重组
Exenatide
HSA
Once a week
第17页/共19页
毕赤酵母表达外源蛋白示例
第4页/共19页
4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修 饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露 糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3 连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用 于临床应用
第11页/共19页
外源蛋白的引入表达
第12页/共19页
菌株类型
第13页/共19页
Mwk.baidu.comt表型与甲醇利用率
Mut 5’AOX基因 3’AOX基因 表型
Mut+ 存在
存在
正表型
Muts 缺失
存在
缓慢型
Mut- 缺失
缺失
负型
第14页/共19页
选择过程
HIS4缺陷培养基
导入质粒
G418酵母培养基
低
高
G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性
第5页/共19页
结构特点
一、单细胞微生物 1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养 2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、
折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量 的蛋白
第6页/共19页
二、微体（也称过氧化物酶体）
1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降 解，亦不会对细胞产生毒害
2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的 第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在 AOX催化下产的H202对细胞的毒害。
第7页/共19页
醇氧化酶（AOX）
甲醇 AOX
甲醛 H2O2
微体 细胞
第8页/共19页
毕赤酵母质粒载体
第9页/共19页
几个概念
• 同源基因重组 ：同源染 色体的非姐妹染色单体的 交叉互换引起的互换重组
第18页/共19页
谢谢大家！！
第19页/共19页
第2页/共19页
• 80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵 母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化 酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株， 开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。
• 1993年Philips pertoleum公司委托Invrtigone公 司代理毕赤酵母表达系统的产品。
第1页/共19页
起源及背景
• 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是8O年 代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
• 30年前Koichi Ogata首次发现有些酵母可以利用 甲醇为唯一的碳源和能源.
• 70年代Philips pertoleum公司就开发出高密度连 续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。
第15页/共19页
发酵过程
一般分为三个阶段： ①成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌
量，该阶段一般采取分批补料的方式进行； ②过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳
源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏； ③诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中
流加甲醇诱导重组蛋白的表达。
第3页/共19页
毕赤酵母与其它表达系统相比 有许多优点
1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度 生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从 而进行高效表达
2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构 稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合 到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株
3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基 因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达
• 穿梭质粒：是指人工构建的 具有两种不同复制起点和选 择标记，可在两种不同类群 宿主中存活和复制的质粒载体。
第10页/共19页
pPIC9k质粒图谱
• AOX--醇氧化酶 • S --- 分泌信号
• MCS –多克隆位点 • TT---终止信号
• HIS4--组氨醇脱氢酶 • Kanamycin---抗卡拉霉素基因 • pBR322---大肠杆菌的复制起始位点 • Ampicillin---抗氨苄青霉素基因
第16页/共19页
应用举例
依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具 有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白
Exenatide
Twice a day
2.4h被代谢
Exenatide
HSA
PCR 基因重组
Exenatide
HSA
Once a week
第17页/共19页
毕赤酵母表达外源蛋白示例
第4页/共19页
4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修 饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露 糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3 连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用 于临床应用
第11页/共19页
外源蛋白的引入表达
第12页/共19页
菌株类型
第13页/共19页
Mwk.baidu.comt表型与甲醇利用率
Mut 5’AOX基因 3’AOX基因 表型
Mut+ 存在
存在
正表型
Muts 缺失
存在
缓慢型
Mut- 缺失
缺失
负型
第14页/共19页
选择过程
HIS4缺陷培养基
导入质粒
G418酵母培养基
低
高
G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性