旋毛虫

摘要
旋毛虫病因具有公共卫生意义而显得非常重要。

旋毛虫的成虫可见于人、猪、小鼠、熊和其他食肉动物的小肠内，也见于喂食含有受感染啮齿动物尸体饲料的马属动物。

其幼虫寄生于宿主的随意肌内形成包囊。

猪旋毛虫的诊断方法可分两类：①直接检查横纹肌组织中一期幼虫包囊。

②查特异性
抗体，问接测定寄生虫存在。

宰前检验时，血清学诊断方法比活体检查更适宜。

血清学方法的灵敏度与直接检查法相同或更好，但在轻度感染或中度感染猪中，在肌幼虫具有感染性后3周或更长时间血清学仍检不出反应，这样的病例可能呈假阴性结果。

．然而，按照传统直接检查方法是检不出每克组织感染3个以下幼虫的。

有报告说，血清学试验有小部分假阳性结果。

病原鉴定两种普通方法即压片法或肌肉组织消化法用于直接检查猪的旋毛虫感染。

两种方法均用于检验严重感染肌肉中的旋毛虫，肌组织感染程度的顺序为膈(肌)脚、舌、咬肌及腹肌；另外，与组织的感染程度还有一定的关系。

在马属动物中成虫主要感染舌肌、咬肌，严重者还可感染隔脚和颈部肌肉。

选择直接检验肉中旋毛虫的方法，取决于设备及待检样品数量。

第一种方法是借助于肌肉组织压片，检查组织内幼虫的存在。

这需设一台专门的显微镜，即旋毛虫镜，这种显微镜估计检测效率为每克组织中至少3～5个左右的包蚴。

这种方法的缺点是，一个胴体要查几个样品，耗费时间太多。

另外这种方法很难测出在肌细胞中不存在的拟气门旋毛虫幼虫。

近年来，几个国家在猪、野生猪和人中报告发生这种旋毛虫。

第二种方法是消化一份或多份肌肉组织样品，再进行选择性筛选，过滤或沉淀程序，最后，用显微镜检查样品中幼虫。

消化方法可借助于机械性搅拌匀浆处理消化物。

消化方法的检验效率约为每克组织3个包蚴。

血清学试验酶联免疫吸附试验(EusA)是宰前诊断旋毛虫病的最佳方法。

其敏感性可与最好的直接法相比，能检出100g组织只有一个幼虫的感染。

ELISA诊断旋毛虫病的特异
性，与试验中使用的抗原类别及性能直接有关。

收集体外短期保存的旋毛虫包蚴的分泌性抗原，能普遍提供最特异最廉价的抗原来源，尽管存在低比例的假阳性结果，已知使用这类抗原不会发生交叉反应。

建议使用分泌性抗原进行ELISA试验，可作为群体监测的措施。

作为一种确诊试验，消化100g组织将能确保诊断的准确性。

对于近期低水平感染的动物可能会出现低比率的假阴性ELISA结果。

疫苗和生物诊断用生物制品要求目前正在进行猪的免疫防制旋毛虫的研究，迄今尚无适用生物制品。

A．诊断技术
旋毛虫病由于其在公共卫生方面的重要性而显得非常重要。

旋毛虫的成虫可见于人、猪、小鼠、熊和其他食肉动物小肠，也见于喂食含有感染啮齿动物或污染的饲料的马属动物。

这种寄生虫有直接生活史，雌虫卵胎生。

幼虫蜕皮后进入乳糜管，然后到淋巴、静脉血，尽管有部分死亡，生存下来的则寄生在随意肌，特别是膈肌和舌肌内，在马属动物还有咬肌内寄生。

现已鉴定了7种毛形(线虫)属种，旋毛虫Trichinella spiralis(又名T．1)分布在温带地区，主要发生在猪，对猪、小鼠、大鼠有高致病力。

本土毛线虫(T．natlva)(T。

2)分布在
较冷地区，对猪感染较轻，主要发现于野犬，熊和海象，由于对冷的耐受力而闻名。

布里拉夫毛线虫(T，richineUa britovi)(T_3)主要见于野生动物，偶见于猫和马，分布于亚欧温带地区。

与其他相比T-3有一些中间特征，包括耐寒性，对猪轻度感染形成的囊较慢(幼虫易与- 无囊膜种相混)。

控制方法有：对肉制品严格检查、蒸煮或冷冻，饲养时要防止饲喂或误食
感染鼠而传染猪或B。

姆里氏毛线虫(Trichinella nurrelli)(T．5)是北美种，常见于野生动物
偶见于-B和人，对猪感染率低，但人食人后危险。

内尔逊毛线虫Trichinella nels,，凡i(T．7)从非洲的野生动物可零星分离到，它的特点是与其他种相比，对温度有抵抗力。

有的种旋毛虫在肌肉中不形成囊，Trichinella pseudospiralis(T-4)在世界各地均有分布。

可见于食肉鸟、野犬、鼠和有袋类，常见于亚洲、北美洲和澳大利亚。

巴布亚毛线虫(Triehi，醒lla p印uae)(T- 10)是一种不形成囊的种。

到目前为止仅见于巴布亚新几内亚另外还发现其他几个种，旋毛虫T-6发现于北美洲，耐寒，对猪感染力低，对各种哺乳动物感染力强，对人有致病力。

T_ 8来自于非洲；与T-3相似，但分子标记鉴定与T一3不同。

T一9也与T-3相似，但在分子上不同。

随着分子技术的发展和比较研究学工作的进行，对种的鉴定应在分类学上进一步得到解决。

有几篇旋毛虫研究报告指出‘。

所有种类的旋毛虫对人均能引起疾病。

人的旋毛虫病是一种非常严重的疾病，甚至可导致死亡。

虫体在小肠内有轻度影响，但当幼虫移行到随意肌时可出现严重症状。

该病通过食入未煮熟的感染的肉而感染。

控制方法是：对肉品严格检查，食人时要蒸煮和冷冻(肉要蒸煮、加工或腌制)，预防已暴露被感染
的肉，包括野生动物、啮齿类动物未加蒸煮的肉品。

野生动物应视为潜在的传染源，其肉品应做全面的检查和蒸煮(丁．nativa或T-2和T．6)由于对寒冷有强的耐受力，故被旋毛虫感染这些冷冻的肉品对公共卫生也有危害。

许多诊断方法可用来检查猪或其他动物旋毛虫感染(旋毛虫病)，如：a)直接检查组织
样品或消化样品中的旋毛虫；b)用血清学方法查特异抗体，间接证明寄生虫的存在。

，
1。

病原鉴定(国际贸易指定试验)
寄生虫直接检查一般专指宰后胴体检查，但宰前活体检查法已有人报道过‘·m。

直检法的敏感性与被检的组织量和采集组织的位置有关。

通常采用的方法是旋毛虫镜检技术，其敏感性为3个蚴虫／lg组织‘。

，∽。

而混合样品消化法的敏感性为1个蚴虫／g组织(3，6]。

直接法能
直接鉴定出感染后17天的猪，这与肌肉内的包囊蚴已对新宿主具有侵染力的时间是一致的，只要包蚴是活的，那麽直接法就长期有效。

在有大量组织(100g)可供消化情况下，本法的
敏感性就大为提高。

直接检查法，特别是旋毛虫检查法的缺点是，耗时、费力、开支大。

旋毛虫病的直接诊断常用的是下面两种方法：
a)旋毛虫镜检或组织压片法
取膈脚肌作为检查样品，将其切成至少28块，每块大小约为2mm×10ram。

-g可取其他部位的样品，如舌、咬肌及腹肌。

但为了作敏感性比较，应采用较大的样品。

将组织块放在两块玻片之间，用力挤压成半透明状。

然后，通过一台特别的投射显微镜，即旋毛虫镜或者一台15～40倍的常规显微镜作虫体检查。

在单个肌细胞上可见卷缩的幼虫。

由于幼虫有囊，肌细胞的形状为卵圆形。

在严重感染时在单个肌细胞上可见多个幼虫。

不形成囊的旋毛虫属，包括拟气门属及其相关属可在肌细胞外见到并不卷缩形状的幼虫。

b)消化法，
肌肉组织可用消化液消化，这样能使肌囊中释放出活的旋毛虫。

这里介绍的是欧共体(Eu)内部常用的四种方法‘’’扪，至于更为全面详细的情况则由欧共体负责咨询，这几种方
法概况如下：
i)人工消化单个样品或混合样品。

ii)机械混合样品消化沉降技术。

iii)用滤器分离技术的机械性混合样品消化法。

iv)混合样品磁力搅拌法。

混合样品磁力搅拌方法能在设备不多的情况下使用，下面是美国所用这种方法的一个
例子
·采样
从膈脚肌处或舌部取肌样，马从舌肌或咬肌处取样。

其他部位的器官组织存在包囊蚴数目一般较少。

样品块大小可以不同，但从一头猪身上采取100g样品，或从许多猪采取许多样品，混在一起为100g。

样品的大小将决定后一种方法的敏感性。

欧共体要求在检查猪胴体时每100g产品中取1g样品。

检查马肉时，要求5g样品。

在美国，猪要求5g样品。

实际操作中，样品最小为5g，即100g的混合样品中含20个动物的样品，样品磨碎或切碎以便消化。

·消化和回收
每100g组织样品用1L人工胃液，内含1％(w／v)胃蛋白酶(1／10 000国家药典)和
1％(v／v)的Hcl(0．12N终浓度)消化。

将磨好或切好的组织样品加入到已预热至37℃的
消化液内，然后放到磁力搅拌器上，在37℃搅动3小时，或在较高温度下可缩短时间(如44～46Cj[；30～60分钟)。

15～20分钟让消化物澄清，将上部2／3的液体倾去。

将余下的液体
和沉渣再通过网眼为355／~m的玻璃漏斗筛滤后，静止15～20分钟。

将上部上清液尽可能吸
去，但不要泛起沉渣。

沉淀用温热(37℃)的自来水冲洗，再静止15～20分钟。

反复冲洗直至上清透亮。

将洗过的沉淀物移入50mI．的试管内，让其静置，吸取最下面的10mI．沉淀。

为了计数，则把所有的10mi．沉淀倒进一个有适当坐标方格的培养平皿内，并用解剖显微镜
(×15～40倍)检查旋毛幼虫。

一期幼虫被消化后脱离肌细胞，大小约11Tlln长0．03mrr。

宽。

旋毛虫幼虫的主要特征是食道部含有圆盘形的一系列细胞，这一部分占身体的半数以上。

旋毛虫幼虫天冷时呈卷曲状，热时运动，若死亡则呈C形。

若有可疑则应用高倍镜或取更多的组织检查。

如果数目较大，则应作适当稀释。

在混合样品消化物中检出包囊蚴时，则必须用组成混合样品的单个样品重复上述检查。

使用一台有恒温控制装置的组织搅拌器可将消化时间缩短到12～15分钟左右，使用
3 500~I’型实验室搅拌器的其他处理混和样品的方法已作过报道‘引。

欧共体(84／319EE(：)也
推荐使用磁力搅拌器处理样品‘扪。

c)虫种鉴定
在肌肉组织取旋毛虫进行鉴定对于评估旋毛虫的流行病学和对人体的危害很重要。

可用设在意大利罗马的世界动物卫生组织(0皿)参考实验室的标准鉴定虫型(见本手册第四
部分)。

2．血清学试验
用于检验寄生虫特异性抗体的EIJSA试验为动物屠宰前后的血清血液检验提供了一种快速的方法。

它能检测到100g组织中只有一个包蚴的低水平感染。

感染猪和马已研制成功几种高度特异性的抗原制品(’。

Ⅲ’。

它们对猪旋毛虫病的诊断具有高度的特异性。

经屠宰检查对照，ELJSA试验假阳性<0．3％(他)，但对每克组织感染1个以上蚴虫的猪敏感。

由于旋毛虫所有型虫种都含有旋毛虫分泌抗原(ES)‘B)，所以在ELISA实验中采用分泌性(Es)抗原来检测旋毛虫的存在。

其他非ELISA试验的血清学方法(如间接免疫荧光试验)缺乏特异性，不适用于检测旋毛虫感染。

猪旋毛虫病血清学诊断的缺点是，在感染猪群出现小部分的假阴性结果。

这样的结果是因为轻度、中等程度感染的猪体内的抗体应答的动力学起动慢或感染了森林旋毛虫的缘故。

这种慢速度的抗体形成，意味着感染后几周内不能作出诊断。

感染后猪的血清学反应至少持续6个月不下降。

据报道马的抗体水平仅能维持几个月。

这与幼虫在肌肉中的下降相一致。

所以马的血清学试验检测方法价值有限。

对于野生捕猎动物中的抗体反应所知有限。

血清学试验与消化法比较，其优点是在检查轻度感染旋毛虫的动物时敏感性提高；这种敏感性对检查农场是否存在持续感染非常有用。

而取样为1g的消化试验，只能检查比每克中有3个幼虫更严重的结果，有些动物尽管感染更严重，但在感染后21～35天血清仍可呈阳性。

因此，血清学检查在监测计划中是很有价值的，在屠宰检查时可替代消化试验。

由于旋毛虫感染通常少见，随机取样并不可靠，应当进行群体检验，这就需要制定整体监测
方案。

·酶联免疫吸附试验
用ELISA诊断旋毛虫病时，使用的抗原为旋毛虫的分泌性抗原(引。

这种分泌性抗原是由分子量为45～55 kDa的糖蛋白组成的。

·抗原制备
试验中所用抗原的质量可决定ELISA的特异性和敏感性。

用u幼虫制备的特异性抗原带有IS抗原表位，可被旋毛虫抗原所识别。

这种抗原可用来检测感染旋毛虫的动物，因所有旋毛虫均有此类抗原。

这种旋毛虫抗原制备采用旋毛虫(r，．spiralis)，由国际旋毛虫中
心(在意大利罗马)命名为T一1。

这种旋毛虫作为重要的诊断抗原在鼠体内需要经过一系列的发育阶段。

制备EL[SA抗原姻’，将去掉皮和内脏并已磨碎的(T．1)旋毛虫。

感染鼠胴体用1％胃蛋白酶和1％Hcl的消化3小时(37℃)后回收旋毛虫的肌肉期幼虫。

幼虫用含有500单位双抗的I)ulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM，含青链霉素各500单位／rnL)浸洗3次，每次20分钟，并放在DMEM完全培养基中(即DMEM中补加下列成分：HPEs(10mM)，谷氨酰胺(2mM)，丙酮酸(1mM)和各50单位的双抗)。

并在10％C02的环境下置37℃培养18～20小时。

回收的培养物，滤去虫体，滤液在3 000 Da分子量的滞留压力下浓缩。

回收的分泌性抗原可短期贮存在一20qC下，或在一’70％：下长期保存；经SDs．聚丙烯凝胶电泳分析表明，这种抗原约含25种蛋白质成分，大部分蛋白质都含有’ISI．．1糖抗原表位。

抗原质量标准与EuSA的特异性具有至关重要的关系。

应通过显微镜分阶段观察或通过样品的平板检测细菌生长情况。

对于有细菌生长的平板应予废弃。

幼虫最长保存时间应少于20小时，超过此时限会由于菌体抗原渗出虫体遭到破坏而降低特异性。

用来作鉴定的抗原在波长为280／260nm的吸收率应大于1．0。

体外培养获得的旋毛虫幼虫的抗原应通过已知阴性、阳性血清反应测定。

·试验程序
以下列举一个用EusA诊断猪感染旋毛虫病的例子。

为获得可靠结果，有必要将试验中所用的各种试剂标化到最适浓度。

例中采用了：
i)用包被缓冲液(50reM碳酸盐／碳酸氢盐缓冲液，pH9．6)将旋毛虫分泌性(Es)抗原
稀释至5弘∥n1IJ，每孔加入100皿包被96孔微量滴定板。

37c：C放置60分钟或4℃过夜。

ii)用洗液(含50mM％s，pH7．4，150mM Na(：1，5．0％脱脂干奶和1．0％|rT4torl x 一100)将
板冲洗3次。

每次洗涤后，将滴定板晾干。

iii)用洗液1：10或1：100稀释猪血清。

另外还可用全血和组织液替代血清‘8)。

加100
稀释的猪血清到抗原包被孔。

每板设与试验血清相同稀释度的已知阳性和阴性血清对照。

温下孵育30分钟。

iv)按ii洗涤3次；
v)用洗液将兔抗猪IgG过氯化物酶结合物作(O．1mg／mL)1：1 000稀释，每孔加
100／~L。

室温下孵育30分钟。

vi)按ii洗涤3次；最后一次用蒸馏水冲洗。

vii)加入100~L适当的过氧化物酶底物[如5’一对氨基水杨酸(0．8mg／mL)含O．005％氧化氢酶解底物，pH5．6～6．0]；
viii)5～15分钟后，在酶标仪I)．2／450nm波长测定微量板的光密度值，当该值达到混合
性对照血清值的4倍粉阳性。

达3倍则判为可疑。

阻断值受猪品种影响。

商业用的ELISA是双抗体夹心法，它使用过氧化物酶标记的抗猪血清。

测定时间短，需时间不应超过1小时。

B．对疫苗和诊断用生物制品的要求
目前正在进行旋毛虫的免疫预防研究，但到目前为止尚无适用的生物制品。