免疫印迹法

免疫印迹法

免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。

免疫印迹法分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。

一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。T是Acr与Bis的总百分浓度，C是Acr：Bis的重量百分比，T恒定，C为4%时，有效孔径最小，C大于或小于4%时，有效孔径均变大；C恒定，T增加，有效孔径降低。聚合过程由TEMED(四甲基乙二胺)和过硫酸铵激发。

阴离子去垢剂SDS能破坏蛋白质中的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷量，掩盖了各种蛋白质分子间的天然电荷差异；加入巯基乙醇使电泳的迁移率不再爱原有分子形状的影响。蛋白质的迁移率将主要取决于其分子量的大小

基本步骤：

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋

白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDS上样缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白，可用来检测多种蛋白，包括磷酸化蛋白。另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解法，低渗缓冲液裂解法。可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提.

2.蛋白质浓度测定：

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。更方便的方法是选用成套的裂解液和定量试剂盒测定蛋白质。如果浓度过高，可按比例稀释，读出蛋白浓度后，再折算回原样品浓度。

3. 电泳(Electrophoresis)

配制SDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X 或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

注意：Acr和Bis单体对神经系统和皮肤有毒性作用，TEMED对粘膜和上呼吸道组织及皮肤有很大的破坏作用

4．电泳结果检查：

如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPRO Tangerine——这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。可惜SYPRO Tangerine价格挺贵的，500ul（5000x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。

二. 电转移：

通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管法转移效率较低。现在多用电泳印迹法，这种方法是用有空的塑料盒有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。

转移膜的选择：Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜,Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龙膜、

DEAE纤维素膜做蛋白印迹。膜的选择要根据a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

几种膜的特点：

NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 高

背景 低 较高 低

结合能力

80－110 ug/cm2 >400 ug/cm2 125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）

材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有

操作程序 缓冲液润湿,避免气

泡

缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿

检测方式 常规染色，可用放射

性和非放射性检测

不能用阴离子染料

常规染色，比较于NC膜，

可用考马斯亮蓝染色，可用

于ECL检测，快速免疫检测

适用范围 0.45um 一般蛋白

0.2um一分子量小于

20kD蛋白0.1um一分

子量小于7kD蛋白

低浓度小分子蛋白、酸性蛋

白、糖蛋白和蛋白多糖(主

要用在核酸检测中)

糖蛋白检测和蛋白质测序

价格 价格较便宜 便宜 较贵

1. 硝酸纤维素（NC）膜

硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力强，适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高；使用也很简便，不需要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而且容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不适合用于需要多次重复清洗的用途。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外由于NC膜上结合的蛋白会因