柱层析分离丙种球蛋白与核黄素(Sephadex—G50,葡聚糖凝胶)

层析技术的基本原理：利用混合物中各组分的 物理、化学性质 的差别，使各组分以不同程 度分布在两相(固 定相、流动相)中达到分离。 凝胶层析的原理：分子筛效应 • 比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全 被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随 流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动 速度快，首先流出。 • 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部， 然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度 慢，后流出。
（三）上样 1. 先将柱的出口打开，让PBS逐渐流出，待 液面与凝胶 床面平齐时，关闭出口（注意： 不可使凝胶柱表面干 涸）。 2. 用刻度吸管取样品混合液0.5ml，沿管壁小 心加于柱床 表面，打开层析柱出口端，待 样品完全渗入胶内，开 始收集流出液，同 时小心加洗脱液（PBS），控制流 速：1滴/5-6秒。（注意柱床上要不 断加PBS，保持1cm 高水层） （四）洗脱、收集与检测 1、流速1滴/5-6秒不变，2ml/管收集 流出液，收集至流出 液为无色。 2、用分光光度计，在280nm波长处， 以PBS调零，测定无 色管吸光度；在 在450nm波长处，以PBS调零，测定有 色 管吸光度。（每管收集液稀释1倍 后测定） 3、以管号为横坐标，吸光度为纵坐 标，绘制洗脱曲线。
实验原理
• 凝胶色谱（Gel chromatography）是以各种 具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据 流动相中所含各种组份的分子不同而达到 物质分离目的的一种色谱技术。 • 凝胶色谱按流动相类型分为两类：当流动 相为有机溶剂时，为凝胶渗透色谱（Gel penetration chromtography,GCP） ;当流动相 为水溶液时，为宁教过滤色谱（Gel filtration chromtography,GFC）。
柱层析分离丙种球蛋白与核黄素 （Sephadex—G50,葡聚糖凝胶）
目录
• • • • • • 基础知识简介 实验目的 实验原理 实验器材和试剂 实验步骤 注意事项
核黄素：维生素B2， 又称核黄素，维他命 B2。 分子式为 C17H20N4O6。是在 自然界分布广泛的一 种维生素。是哺乳动 物必需的营养物，其 辅酶形式是黄素单核 苷酸和黄素腺嘌呤二 核苷酸。
• 性状 冻干制剂应为白色或灰白色的疏松体，液体制剂 和冻干制剂溶解后，溶液应为接近无色或淡黄色 的澄明液体，微带乳光。但不应含有异物或摇不 散的沉淀。 • 药理作用 注射丙种球蛋白是一种被动免疫疗法。它是把免 疫球蛋白内含有的大量抗体输给受者，使之从低 或无免疫状态很快达到暂时免疫保护状态。由于 抗体与抗原相互作用起到直接中和毒素与杀死细 菌和病毒。因此免疫球蛋白制品对预防细菌、病 毒性感染有一定的作用
作为维生素B族的成员之 一，核黄素水溶性较 低，但在碱性溶液中 容易溶解，在强酸溶液 中稳定，光照及紫 外照射引起不可逆的分解。 可溶于氯化钠 溶液，维生素B2是机体中许多 酶系统的重 要辅基的组成成分，参与物质和 能量代谢。 核黄素在机体中有递氢的作用， 并是机体 中一些重要的氧化还原酶的辅酶。
维生素B2的生理功能 1、 参与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢可提高 肌体对蛋白质的利用率，促进生长发育。 2、 参与细胞的生长代谢，是肌体组织代谢和修复的必须 营养素。 3、 强化肝功能、调节肾上腺素的分泌。 4、 保护皮肤毛囊粘膜及皮脂腺的功能。 5、 增强视力 作用机理 核黄素即维生素B2与特定的蛋白质结合生成黄酶。黄酶在 物质代谢中起传递氢的作用，参与组织的呼吸过程。 核黄素的主要生理功用是作为辅酶促进代谢。核黄素和磷 酸及一分子蛋白质结合成为黄色酶。这一类酶又叫脱氢酶， 重要的是要非常介导的氢原子转移对糖、脂和氨基酸的代谢 都很重要。它是许多动物和微生物生长的必需因素。 为防止核黄素短缺症，应注意保护食物中的核黄素。（吃 面条的时候，三分之一到一半的核黄素进入了面汤）
三、试剂、器材：
1 层析介质：Sephadex G-50 2 样品（包含2个组分）： ①核黄素（黄色）， ②丙种球蛋白， 上样量：0.5ml/柱。 3 洗脱液： 0.1mol/L,Ph7.2的磷酸盐缓冲液 （PBS） 4 层析柱、分光光度计等。
实验步骤
（一）凝胶的准备 称取Sephadex G-50 3g，臵于锥形瓶中， 加PBS约50ml，在沸水浴中加热2h溶胀 凝胶，用PBS漂洗，去 除飘浮的细小颗 粒，冷却到室温后再装柱。 （二）装柱 1. 取层析柱，洗净，检查出口； 将层析柱固定在支架上， 调 整层析柱与水平面垂直。 2. 关层析柱出口，先用约 10ml PBS预洗柱子，放出 洗液； 再加PBS至2cm高， 然后关闭层析柱的出口。2cm 砂芯 3. 将凝胶悬液（约40ml）沿玻璃棒小 心地徐徐灌入柱中， 待底部凝胶沉 积2cm高时，再打开出口，继续加入 凝胶悬液 至凝胶沉积约8cm的高度即 可，关闭出口（要求凝胶床无气 泡、 无断层、表面平整）。 4. 新柱装好后，加3-5倍体积PBS流过 柱床，然后平衡 10min。（注意：始 终层析柱与水平面垂直）
参考文献
[1]. 国外交联葡聚糖凝胶应用的动态[J]. 医药工业,1973,07:37-54. [2]童朝阳. 长效核黄素的分离纯化工艺及定向合成研究[D].中国 人民解放军军事医学科学院,2002. [3]吴强,黄亚平,李南林,罗亮,刘颖,赖英,郭中平. 应用层析技术提 高低pH静脉注射丙种球蛋白制剂质量[J]. 中国生物制品学杂 志,2000,02:114-117. [4]曾家豫,冯克宽,王渭霞,张振霞. 葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤 维素酶的研究[J]. 西北师范大学学报(自然科学版),1998,04:74-76. [5]黎小清,白旭华,刘昌芬. 凝胶过滤层析纯化辣木絮凝剂研究[J]. 热带农业科技,2008,02:35-37. [6]史伟,禹婷. 蛋白质的层析分离[J]. 内蒙古农业技,2011,01:110112. [7]http://www.baidu.com
丙种球蛋白：
• 按其来源不同可分为两种， 一种是从健康人 静脉血中提取制成的人血 丙种球蛋白，另一 种是从健康人胎盘血中பைடு நூலகம்提取制成的人胎盘血 丙种球蛋白。二者作 用相同，后者价格低于 前者，且用量多于 前者，但目前已停产。有 些人盲目地、错 误地认为丙种球蛋白是营养 药、是补针， 于是不管病情轻重、有病无病 地滥用，结 果会导致不良反应。
实验注意事项
• 装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意 晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。 • 加样时吸管伸入柱内，接近液面处沿管壁加 入，动作要轻柔，不要将床面冲起。 • 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶 始终处于PBS中，防止PBS排空。 • 在收集过程中，要保持流出液的流速稳定，洗 脱速度控制在4滴/min • 液面始终高于凝胶平面否则会导致干柱 • 装柱避免出现断层、气泡