氯仿法、水解法、卡拉胶法提取鸡蛋中卵黄抗体

氯仿法、水解法、卡拉胶法提取鸡蛋中卵黄抗体

【摘要】卵黄抗体（egg-yolk antibody，IgY）具有一些IgG所没有的优良特性，与哺乳动物的IgG相比，IgY 的提取具有方法简单，提取率高且方法多样等优点。本文旨在对当前条件下卵黄抗体的提取方法进行比较。选取水溶法（Water Dilution，WD）、氯仿法（Chloroform，CHL）和卡拉胶法（Carrageenan，CAR）制备IgY，根据电泳结果，比较三种方法得率高低。SDS-PAGE结果表明，氯仿法的得率较其他两种方法高一些。

【关键词】卵黄抗体；提取；电泳

1.1 卵黄抗体的发现和命名

1893年，Klemperer首次报道了鸡蛋中存在抗体，发现蛋黄中抗体以IgG占优势，而IgM和IgA的含量很少，现已证明了免疫鸡的蛋是提供特异性IgG抗体最方便，最廉价的来源[1]。由于鸡蛋黄的英文名称是“Yolk”，故将鸡蛋黄中的免疫球蛋白IgG称为IgY。

1.2 卵黄抗体的一般性质

卵黄抗体相对分子量约为180kDa，有两条轻链和两条重链组成（2H+2L）。其中轻链（L）相对分子量约为22～30kDa，重链（H）相对分子量约为67～70kDa，等电点接近5.2，含氮量为14.8%，IgY的氨基酸组成与鸡血清IgG和牛IgG不同。此外，还具有以下优点：

（1）鸡卵黄中IgY纯度高，含量大。

（2）特异性高。

（3）稳定性好。在室温保存半年，其抗体活性不变，在4℃冰箱贮存6-7年，经免疫扩散法测定其活性降低不超过5%[2]。

（4）产量高。

（5）IgY不激活补体。

（6）IgY能耐酸耐热。

（7）安全。服用安全可靠，王泽中等用治疗剂量（80-300mg/kg）的10-40倍进行试验，没有发现毒性反应。

1.3 IgY的分离、提纯方法

卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白（α、β、γ）是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。

多年来，已建立许多较为高效而经济的方法，大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

1.4 IgY的作用机理

特定病原菌的卵黄抗体能直接粘附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长。卵黄抗体可粘附于细菌的菌毛上，是指不能粘附于肠道粘膜上皮细胞。一部分卵黄抗体在肠道内被消化酶降解为可结合片段，这些片段含有抗体末端的可变小肽（Fab部分），这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定病原菌粘附因子结合，使病原菌不能粘附易感细胞而失去致病性。

1.5 IgY在医学方面的应用

抗细菌感染：沙门氏菌是肠道感染的常见病原菌，Lee EN等在体外实验中发现，特异性抗沙门氏菌的IgY能有效防治人类沙门氏菌性肠炎。

抗病毒感染：轮状病毒是引起秋冬季婴幼儿腹泻的主要病原体之一，目前尚无有效的疫苗。荫俊（2000）[3]、郭立君等（2001）[4]，分别对抗轮状病毒IgY 的研制及生物学活性等方面进行了研究。

抗肿瘤治疗：Hensel T等制备了鸡抗金属蛋白酶的IgY[5]。在小鼠体外试验中，这种抗体可中和金属蛋白酶的蛋白分解活性，特异地抑制C6胶质瘤细胞在视神经外植体中的扩散和浸润。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 原料：新鲜鸡蛋。

2.1.2 试剂：药品（氯仿、卡拉胶、木瓜蛋白酶）。

缓冲液：

分离胶、浓缩胶缓冲液的配制

电泳缓冲液、样品缓冲液的配制

浓缩胶（5%）、分离胶（15%）的配制

2.1.3 仪器和设备

不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器、医用型洁净工作台、台式离心机、PHS-25C 型数字酸度计、DYY-6C型电泳仪及垂直电泳槽、冷藏冷冻箱、移液枪及枪头、烧杯、三角瓶、容量瓶、玻璃棒等。

2.2 实验步骤

将所需使用的烧杯、三角瓶等玻璃器具于高压灭菌锅中于121℃，0.14兆帕杀菌15分钟。

无菌水的制备：取一罐头瓶装水（不可太满），半封口，按上法杀菌，开锅后将其拧紧，备用。

蛋黄制备：超净工作台使用前杀菌30分钟，用酒精将鸡蛋表面棉擦拭干净，于气室端破口，用注射器吸取蛋清，并不断扩大小口，待蛋清吸出后，（切勿损坏蛋黄膜）用无菌水清洗2-3遍，换注射器破蛋黄膜，吸取蛋黄。

2.2.1 水溶法

取5mL蛋黄于烧杯中，加入45mL无菌水，摇匀，调节pH至5.2，倒入三角瓶中，于冰箱内4℃冷藏6小时，按同样方法做一对比试验，冷藏8小时，后以3000r/min离心20分钟，取上清液倒入试管中4℃冷藏。

2.2.2 卡拉胶法

称取0.1g卡拉胶倒入试管，加适量无菌水，加热溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，摇匀。取10mL蛋黄、90mL卡拉胶液于三角瓶中混合，摇匀，室温静置2小时，离心，取上清液倒入试管中4℃冷藏。

2.2.3 氯仿法

取20mL氯仿、20mL生理盐水、10mL蛋黄于三角瓶中混合，摇匀，离心3000r/min，20分钟。离心后管内物质分3层，上层清夜（抗体所在部分），中层蛋黄，下层氯仿。取出抗体液倒入试管中4℃保藏。

2.3 酶解

从上述各试管中取少量样品，按1%量加入木瓜蛋白酶，在65℃条件下，酶解6h。然后于85℃水浴加热灭酶15min。2.4 SDS-PAGE电泳

编号：如下表1

流程：

（1）样品处理：将缓冲液与样品按1∶1比例混合加入PCR管内，封口，沸水浴中煮3min。

（2）电泳流程：洗平板→灌分离胶→（无菌水）液封→凝固→排水→灌浓缩胶→插梳子→翻版→去封条→灌注电泳缓冲内液→点样→外液→35mA ，86V，4h电泳→染色→ 脱色→刮胶→成像。

3 结果与分析

鸡卵黄中含水48%，蛋白质17.8%，脂肪30.5%，其中几乎所有脂肪都与蛋白质结合形成脂蛋白。IgY提取的一般原理就是将IgY与脂蛋白分离。

3.1 水溶法

结果描述：两支试管内溶液澄清透明。

原理：蛋白质在等电点处溶解度最小，pH5.2时，脂蛋白将形成颗粒，可以离心除去，IgY水溶，可以留在上清液中。

3.2 卡拉胶法

3.2.1 离心结果描述及分析

3.2.2 冷藏效果分析：冷藏24小时后溶液分3层，中层为蛋黄残留的透明液，经二次离心（5000r/min）冷藏，分层后可得到理想状态样品。

原理：卡拉胶可以络合脂蛋白，经离心后，可与IgY分离。

3.3 氯仿法

结果描述：溶液澄清透明。

原理：脂类物质易溶于有机溶剂（氯仿），离心后，与IgY分离。

3.4 电泳

将各种方法提取的IgY进行SDS-PAGE，结果如图1所示。

由图1可知：1、3、5、7（皆为未酶解之原样品带）条带带形近似，A、B 两主带相同，可知四管内所含物质相同，均为IgY。各样品条带降解严重，据此可知各样品已发生降解。原因：样品储藏时间可能过长。偶数条带内没有蛋白质