荧光免疫试验优秀课件

5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素 作用下，发射荧光减弱甚至消退称为 荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯 胺、酚、硝基苯、I-等 。
荧光淬灭
如何避免： 勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存
猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质
（二）荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率 ------荧光效率
激发光强度及激发光波长
决定于
发射荧光的光量子数（荧光强度）
荧光效率 ＝
吸收光的光量子数（激发光强度）
决定于
荧光色素本身的物理特性
4.荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生 的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。 ➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
间接荧光抗体染色法示意图
间接免疫荧光法示意图
间接法：
优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体
缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长
应用：自身抗体的检测
二、实验方法
标本片上滴加特异性抗体 37℃30min PBS洗涤 滴加二抗
37℃30min PBS洗涤 镜检
1ຫໍສະໝຸດ Baidu抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG
2 荧光素要求
❖有能与蛋白质形成共价健的化学基团 ❖荧光效率高， ❖荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。 ❖与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。 ❖标记方法简单、安全无毒。 ❖与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
第二节 间接免疫荧光试验
一、基本原理
特异性抗体与相 应抗原反应，荧 光素标记的抗抗 体再与第一抗体 结合。
荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):
以荧光物质标记抗体和抗原，通过与 相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以 此对待测物进行定位、定性和定量分析的 检测技术，具有高度特异性、敏感性和直 观性，是最早出现的免疫标记技术。
第一节 荧光免疫试验的组成要素
荧光物质吸收激发光的能量后， 电子从基态跃迁到激发态，当其回 复至基态时，以发射光形式释放出 能量，称为荧光。
见波长的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间，
作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。
光路
荧光显微镜
透射光：照明光线从标
本下经聚光器透过标本
进入物镜。
落射光：照明光线从标
本上经垂直照明器落射
到标本，经标本反射进
入物镜。
透射荧光显微镜光路 落射荧光显微镜光路
(a)
(b)
三、荧光素-抗体结合物
三、注意事项
1.荧光染色时间：一小时内或2~8℃保存4小时， 2.三种对照：①阳对：阳性血清+荧光标记物
②阴对：阴性血清+荧光标记物 ③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 3.标本片需保持湿润，避免干燥 4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本 上
荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。 ++ ：荧光明亮。 +++：耀眼强荧光。
时间分辨荧光免疫测定
2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波 长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光 谱和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
3.发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏 度高
双标记FAT、流式 细胞术
双标记或多标记 FAT
时间分辨荧光免疫 测定
二、荧光显微镜
荧光显微镜
利用一定波长的激发 光对待测标本进行激发， 产生一定波长的荧光， 对组织细胞结构或其组 分进行定性、定位和半 定量分析检测。
滤光片
荧光显微镜
隔热滤光片： 位于灯室聚光器前， 作用阻断红外线通过而隔热。
激发滤光片： 位于光源和物镜之间， 作用能选择性地透过紫外线可
基态
吸收能量
激发态
荧光效率
荧光特点：
1 可产生荧光的分子或原子在接受 能量后即刻引起发光；
2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消 失；
一 荧光及荧光物质基础知识
(一)荧光的基本知识 1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同 波长下记录到的标本发射荧光的谱图。
2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用 不同波长的激发光照射标品得到的荧光 的谱图。
特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈或±。 根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
第三节 流式荧光免疫试验
流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):
采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行 高通量分析的检测方法。
悬浮阵列；流式微球阵列
最大吸收 光谱
490～ 495nm
570～ 575nm
最大发射光谱
520～530nm （黄绿色） 595～600nm （橙红色）
应用
FAT、荧光偏振免 疫测定 FITC的衬比染色或 双标记FAT
藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
490560nm
354nm
Eu3+螯合物
340nm
595nm （红色） 430nm （蓝色） 613nm
第四节
其他与荧光检测相关的免疫试验
其他荧光免疫试验
时间分辨荧光免疫测定 荧光偏振免疫测定 荧光酶免疫测定
一、时间分辨荧光免疫测定
（一）基本原理
1.时间分辨
➢自发荧光寿命短:1ns～10ns ➢镧系元素寿命长:10μs～ 1000μs ➢短寿命荧光完全衰变后再测定 镧系元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
荧光免疫试验优秀课件
教学目的
掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色 与结果判断。
熟悉：荧光物质。 了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的
基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫 技术的应用。
第一节 荧光免疫试验的组成因素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素
时间分辨荧光免疫测定
4.荧光标记物的相对比活性 比活性 ：单位时间内每个标记分子 可被探测到的信号量。
Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒 大大提高了荧光标记物比活性
时间分辨荧光免疫测定
5.信号增强
酸性增强液
Eu3+标记
结合β-二酮体
抗原抗体
Eu3+