荧光免疫试验优秀课件
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免疫荧光技术PPT课件
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
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2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
《间接免疫荧光实验》课件
的准确性和可靠性。
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
临床免疫学检验 课件 第8章 荧光免疫技术
3、花菁染料 (Cyanine Dyes ，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定
性较强，荧光量子产率较高，对pH 等环境不敏感。常 用于多重染色。
Cy2比FITC 更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗 淬灭性更好。
Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更 弱。
指荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退的现象。 原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、ＫＩ、铁、汞、镍等。 有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯
处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 ? 铕(Eu 3+)（应用最广）、 铽(Tb 3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 ? 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) ? 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
（对羟基苯乙酸）的底物。 ? 应用：酶免疫荧光分析
②阻挡滤片（barrier filter ）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410～650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。
OG( 橙黄色)：
GG( 淡绿色)：
③隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线
3）镜头: 需消色差、无荧光
4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织
第八章 荧光免疫技术
Fluoroimmunoassay, FIA
荧光免疫技术
免疫荧光组化技术PPT课件
详细描述
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
医学免疫学检验免疫荧光技术课件
成本较高
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
皮肤科免疫荧光技术PPT优秀案例课件
如梅毒螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、疱疹病毒等
免疫荧光镜下天观（膜类带天疱呈疮线患者状标沉本）积，荧
直接法将荧光素标记的抗体与标本中的抗原直接结合进而荧光反应。
镜下可见荧光抗体I光gG于阳表性皮棘。细胞间呈网状沉积，荧光阳性。
C3补体
16
免疫荧光原理示意图
4
临床常用荧光素染料
⑴异硫氰酸荧光素（FITC） λ吸=490495nm 、λ发=520530nm、黄绿色荧光
⑵四乙基罗丹明（RIB200） λ吸=570nm、 λ发=595～600nm、呈橘红色荧
光
⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） λ吸=550nm、 λ发=620nm、呈橙红色荧光
皮肤科免疫荧光技术
1
优选皮肤科免疫荧光技术
2
免疫荧光技术概述
原理
将不影响抗原抗体活性的荧光色素
标记在抗体（或抗原）上，与其相应的
抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜
下呈现一种特异性荧光反应。
分类
直接法将荧光素标记的抗体与标本中的 抗原直接结合进而荧光反应。
间接法将荧光素标记的抗抗体与相应的 特异性抗体抗原复合物反应，形成抗原 3
组织修材，成 适合冰冻包埋 块的大小
冰冻切片
抗原与荧光抗 体结合
荧光显微镜下 镜检及成像， 打印报告
9
操作方法及流程
10
操作方法及流程
间接免疫荧光染色步骤
11
实验室操作图片
直接荧光组织修材
12
冰冻切片
实验室操作图片
荧光染色
水浴孵育
13
实验室操作图片
荧光显微镜镜检
14
免疫荧光镜下天观（天疱疮患者标本）
结绨组织病如红斑狼疮等 ⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） ⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 免疫荧光镜下天观（天疱疮患者标本）
免疫荧光镜下天观（膜类带天疱呈疮线患者状标沉本）积，荧
直接法将荧光素标记的抗体与标本中的抗原直接结合进而荧光反应。
镜下可见荧光抗体I光gG于阳表性皮棘。细胞间呈网状沉积，荧光阳性。
C3补体
16
免疫荧光原理示意图
4
临床常用荧光素染料
⑴异硫氰酸荧光素（FITC） λ吸=490495nm 、λ发=520530nm、黄绿色荧光
⑵四乙基罗丹明（RIB200） λ吸=570nm、 λ发=595～600nm、呈橘红色荧
光
⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） λ吸=550nm、 λ发=620nm、呈橙红色荧光
皮肤科免疫荧光技术
1
优选皮肤科免疫荧光技术
2
免疫荧光技术概述
原理
将不影响抗原抗体活性的荧光色素
标记在抗体（或抗原）上，与其相应的
抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜
下呈现一种特异性荧光反应。
分类
直接法将荧光素标记的抗体与标本中的 抗原直接结合进而荧光反应。
间接法将荧光素标记的抗抗体与相应的 特异性抗体抗原复合物反应，形成抗原 3
组织修材，成 适合冰冻包埋 块的大小
冰冻切片
抗原与荧光抗 体结合
荧光显微镜下 镜检及成像， 打印报告
9
操作方法及流程
10
操作方法及流程
间接免疫荧光染色步骤
11
实验室操作图片
直接荧光组织修材
12
冰冻切片
实验室操作图片
荧光染色
水浴孵育
13
实验室操作图片
荧光显微镜镜检
14
免疫荧光镜下天观（天疱疮患者标本）
结绨组织病如红斑狼疮等 ⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） ⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 免疫荧光镜下天观（天疱疮患者标本）
荧光偏振免疫分析PPT课件
↓ 冲洗管路
↓ 探针内部清洗
↓ 样品检测
第44页/共55页
仪器的关闭
探针内部清洗 ↓
关机
第45页/共55页
AxSYM日常保养
第46页/共55页
每周保养
探针外部清洗 ↓
冲洗站清洗 ↓
1,３号注液器清洗 ↓
清洁过滤网
第47页/共55页
每周保养
↓ FPIA和MEIA的光路检查
↓ 清洁样品篮和样品管托架
第23页/共55页
系统控制中心
• 样品/测试放置清单 • 结果浏览 • 报告/选择结果 • 动态时间显示和批处理结果 • 病人结果打印 • 结果保存和归档 • 定标浏览 • Levey Jennings 质控图 • 库存监控 • 自动 “菜单操做保养”
第24页/共55页
纤维杯容器
玻璃纤维杯用于MEIA方法 的微粒子捕捉
>1500/>25 0 >2500/>12 5
DPC Immulite/ Immulite 2000/100 --/--/100
>5000/>200 0/200
J&J Vitros ECi
Roche
2010/1010/ E170
->1000
600/200/50
4000/2000/ 300
20000
18000 16000 14000 12000 10000
5000 4000 3000 2000 1000
0
Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
↓ 探针内部清洗
↓ 样品检测
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仪器的关闭
探针内部清洗 ↓
关机
第45页/共55页
AxSYM日常保养
第46页/共55页
每周保养
探针外部清洗 ↓
冲洗站清洗 ↓
1,３号注液器清洗 ↓
清洁过滤网
第47页/共55页
每周保养
↓ FPIA和MEIA的光路检查
↓ 清洁样品篮和样品管托架
第23页/共55页
系统控制中心
• 样品/测试放置清单 • 结果浏览 • 报告/选择结果 • 动态时间显示和批处理结果 • 病人结果打印 • 结果保存和归档 • 定标浏览 • Levey Jennings 质控图 • 库存监控 • 自动 “菜单操做保养”
第24页/共55页
纤维杯容器
玻璃纤维杯用于MEIA方法 的微粒子捕捉
>1500/>25 0 >2500/>12 5
DPC Immulite/ Immulite 2000/100 --/--/100
>5000/>200 0/200
J&J Vitros ECi
Roche
2010/1010/ E170
->1000
600/200/50
4000/2000/ 300
20000
18000 16000 14000 12000 10000
5000 4000 3000 2000 1000
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Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•免疫荧光技术概述•免疫荧光技术的基本原理和步骤•免疫荧光技术的临床应用•免疫荧光技术的质量控制和标准化•总结与展望01免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
定义免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理免疫荧光技术的定义和原理1免疫荧光技术的应用范围23免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
临床诊断免疫荧光技术还可用于细胞生物学、分子生物学等基础研究中，研究细胞和分子的定位、表达、相互作用等。
基础研究免疫荧光技术可用于药物筛选和药物作用机制研究，通过观察药物与细胞或组织的作用，评估药物的疗效和安全性。
药物研发20世纪40年代免疫荧光技术由瑞典科学家Axelsson和英国科学家Coons首次建立。
20世纪60年代免疫荧光技术得到广泛应用和发展，逐渐成为医学、生物学等领域的重要技术手段。
21世纪初随着新技术如激光共聚焦显微镜、多光子显微镜等的应用，免疫荧光技术不断发展，提高了分辨率和灵敏度，拓展了应用范围。
免疫荧光技术的发展历程02免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应，即利用特异性抗体与相应抗原的结合反应，实现目标抗原的检测和识别。
免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
样品制备将待检测组织或细胞制备成单细胞悬液，固定在载玻片上，制成涂片或组织切片。
免疫荧光染色将制备好的样品进行预处理，加入荧光抗体标记的一抗，室温孵育一定时间；洗涤后加入荧光标记的二抗，再次室温孵育一定时间；洗涤后加入缓冲甘油等封片介质，封片。
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3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率 ------荧光效率
激发光强度及激发光波长
决定于
发射荧光的光量子数（荧光强度）
荧光效率 ＝
吸收光的光量子数（激发光强度）
决定于
荧光色素本身的物理特性
4.荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生 的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。 ➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
时间分辨荧光免疫测定
2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波 长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光 谱和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
3.发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏 度高
双标记FAT、流式 细胞术
双标记或多标记 FAT
时间分辨荧光免疫 测定
二、荧光显微镜
荧光显微镜
利用一定波长的激发 光对待测标本进行激发， 产生一定波长的荧光， 对组织细胞结构或其组 分进行定性、定位和半 定量分析检测。
滤光片
荧光显微镜
隔热滤光片： 位于灯室聚光器前， 作用阻断红外线通过而隔热。
激发滤光片： 位于光源和物镜之间， 作用能选择性地透过紫外线可
见波长的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间，
作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。
光路
荧光显微镜
透射光：照明光线从标
本下经聚光器透过标本
进入物镜。
落射光：照明光线从标
本上经垂直照明器落射
到标本，经标本反射进
入物镜。
透射荧光显微镜光路 落射荧光显微镜光路
(a)
(b)
三、荧光素-抗体结合物
荧光免疫试验优秀课件
教学目的
掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色 与结果判断。
熟悉：荧光物质。 了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的
基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫 技术的应用。
第一节 荧光免疫试验的组成因素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素
基态
吸收能量
激发态
荧光效率
荧光特点：
1 可产生荧光的分子或原子在接受 能量后即刻引起发光；
2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消 失；
一 荧光及荧光物质基础知识
(一)荧光的基本知识 1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同 波长下记录到的标本发射荧光的谱图。
2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用 不同波长的激发光照射标品得到的荧光 的谱图。
第四节
其他与荧光检测相关的免疫试验
其他荧光免疫试验
时间分辨荧光免疫测定 荧光偏振免疫测定 荧光酶免疫测定
一、时间分辨荧光免疫测定
（一）基本原理
1.时间分辨
➢自发荧光寿命短:1ns～10ns ➢镧系元素寿命长:10μs～ 1000μs ➢短寿命荧光完全衰变后再测定 镧系元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈或±。 根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
第三节 流式荧光免疫试验
流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):
采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行 高通量分析的检测方法。
悬浮阵列；流式微球阵列
间接荧光抗体染色法示意图
间接免疫荧光法示意图
间接法：
优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体
缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长
应用：自身抗体的检测
二、实验方法
标本片上滴加特异性抗体 37℃30min PBS洗涤 滴加二抗
37℃30min PBS洗涤 镜检
1、抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG
2 荧光素要求
❖有能与蛋白质形成共价健的化学基团 ❖荧光效率高， ❖荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。 ❖与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。 ❖标记方法简单、安全无毒。 ❖与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
第二节 间接免疫荧光试验
一、基本原理
特异性抗体与相 应抗原反应，荧 光素标记的抗抗 体再与第一抗体 结合。
三、注意事项
1.荧光染色时间：一小时内或2~8℃保存4小时， 2.三种对照：①阳对：阳性血清+荧光标记物
②阴对：阴性血清+荧光标记物 ③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 3.标本片需保持湿润，避免干燥 4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本 上
荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。 ++ ：荧光明亮。 +++：耀眼强荧光。
荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):
以荧光物质标记抗体和抗原，通过与 相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以 此对待测物进行定位、定性和定量分析的 检测技术，具有高度特异性、敏感性和直 观性，是最早出现的免疫标记技术。
第一节 荧光免疫试验的组成要素
荧光物质吸收激发光的能量后， 电子从基态跃迁到激发态，当其回 复至基态时，以发射光形式释放出 能量，称为荧光。
时间分辨荧光免疫测定
4.荧光标记物的相对比活性 比活性 ：单位时间内每个标记分子 可被探测到的信号量。
Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒 大大提高了荧光标记物比活性
时间分辨荧光免疫测定
5.信号增强
酸性增强液
Eu3+标记
结合β-二酮体
抗原抗体
Eu3+
5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素 作用下，发射荧光减弱甚至消退称为 荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯 胺、酚、硝基苯、I-等 。
荧光淬灭
如何避免： 勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存
猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质
（二）荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
最大吸收 光谱
490～ 495nm
570～ 575nm
最大发射光谱
）
应用
FAT、荧光偏振免 疫测定 FITC的衬比染色或 双标记FAT
藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
490560nm
354nm
Eu3+螯合物
340nm
595nm （红色） 430nm （蓝色） 613nm