免疫沉淀试验PPT课件

各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体
稀释度
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640
对照
伪浊度形成的原因
1.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂 抗体成分
2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当 3.样品本身的浊度处理不当 4.试剂污染变质 5.比色杯不够清洁
第三节 凝胶内免疫沉淀试 验
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶 中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗 体相遇并且浓度比例适当的位置形 成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳技术
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
I≈Iθ;θ＜90°，散射
光的量代表IC的量。
IC
透射比浊试
验
θI
检测器A
检测器B
Iθ 散射比浊试
验
补充：免疫浊度测定影响因素
（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量 （2）抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强，并使用R型抗体 （3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5 （4）增浊剂
仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 已知含量的标准品 待测品含量在1.25g/ml以上
一、单Βιβλιοθήκη Baidu免疫扩散试验
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病理血清
应用
IgG、IgA、IgM、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白
等多种血浆蛋白的检测
二、双向免疫扩散试验
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h 以上,可见T3为直线，T1为反抛物线
t1 为 16-24h ； t2 为 24-48h ； t3 为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛 物线
待检蛋白质抗原须具备的条件
优 点：
稳定性好、简便快速，易于自动化 敏感度高 精确度高 无放射性核素污染
分 类：
1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法
2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法
3.免疫胶乳比浊法
透射比浊试验和散射比浊试验光路
I0
当复合物＜3×106dal，
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++
++
++ +++ ++
+
—
1/20
+
++
++
++ +++ ++
+
—
1/40 —
±
+
+
++
++ +
++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
—
二、免疫浊度测定
原理： 当可溶性抗原与相应抗体特异结
合，二者比例合适时，在增浊剂中 它们快速形成一定大小的抗原抗体 复合物，使反应液体出现浊度。
技术要点： 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散
二、双向免疫扩散试验
1.判断抗原或抗体的存在 2.分析抗原或抗体相
以及估计相对含量
对分子量
二、双向免疫扩散试验
3.分析抗原的性质
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2021/4/8
可编辑
二、双向免疫扩散试验
4.滴定抗体的效价 5.鉴定抗原或抗体 纯度
（1）抗原抗体的比例
海德堡曲线
在抗体过量的反应体系中,抗原量的 递增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例 合适时反应达峰值,而当抗原过量时,形 成的免疫复合物分子小,浊度反而下降的 一个抛物曲线。
（2）抗体的质量
•抗体的特异性 •抗体的效价(>1:20) •抗体的亲和力 •R型和H型抗体（R型）
（3）抗原抗体反应的环境 最适PH为：6.5-8.5 离子强度大，IC形成快 离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液 （4）增浊剂 PEG(6000—8000) 浓度4%吐温-20
第二节 液体免疫沉淀试验
第二节 液体免疫沉淀试验
一、絮状免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应 抗体混合，在电解质存在的条件下， 抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状 沉淀物。
一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
絮 状 沉 淀 示意图
应用
1.AFP检测的最早方法
2.血清中含量较高的酶类、细 菌病毒感染后血清中产生的抗 体的检测
三、免疫电泳技术
三、免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点：
1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
•电泳（electrophoresis） ：在外加
反应介质：凝胶 凝胶的特点： 1、固相的液体 2、多孔的网状结构 3、Ag-Ab复合物网络在凝胶中
一、单向免疫扩散试验
定量试验
原理：抗体与待测的抗 原,在两者比例合适 的部位结合形成沉淀 环。环的大小与抗原 的浓度成正相关。
技术要点：
1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 5.绘制标准曲线
一、单向免疫扩散试验
第六章 免疫沉淀试验
教学目的
掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验 原理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉 淀现象。
电渗方向与样品运动方向一致： 样品迁移率加快
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退
电场的作用下带电颗粒向着其电性相 反的电极移动，称为电泳。
电泳迁移率： 定义：同一电场条件下，各种带电粒子在
单位时间内移动的距离。M=cm2/VS 影响泳动的速度的因素:
本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH值 溶液离子强度 电渗
电渗： 电场中液体相对于固体的运动
①载体的性质 ②缓冲液的离子强度 ③电泳时的电压