基因敲除技术

２０１７年第４期87农业科技

自１９８７年Ｃａｐｅｃｃｈｉ等采用小鼠胚胎干细胞成功介导定向基因转移（也叫做基因打靶），使小鼠体内的特定基因丧失功能以来，基因敲除已成为一种精确地人工修饰基因组的途径，并首先在模式生物小鼠中建立。基因敲除技术不仅可以研究基因功能、创造有特定经济价值的动物，而且可以指导对人类基因的研究，在阐明人类疾病地说发生机理、开发更为有效的治疗手段及药物中具有重要价值。

1、基因敲除技术的基本原理

基因打靶是在同源重组和ＥＳ细胞成功分离的基础之上实现的［１－２］。基因敲除技术应用ＤＮＡ同源重组原理，利用一段人工修饰的同源片段代替靶基因片段，使外源基因引入基因组ＤＮＡ的特定片段上，随基因组ＤＮＡ的复制而稳定复制，从而达到基因敲除的目的。在基因敲除中，实现基因定点整合的唯一途径就是利用遗传物质的同源重组机制。

2、基因敲除技术的必要条件

２．１、打靶载体的构建。一般来说，打靶载体包含与基因座上相应的ＤＮＡ序列完全同源的２～１０ｋｂ序列、经过修改后的目标基因序列和标记基因，为方便从转化细胞中挑选发生同源整合的细胞。

常用的打靶载体有两类—插入型和置换型。插入型载体通常是由某些逆转录病毒介导的［３］，其断裂位点通常位于同源序列内，选择基因与同源目的序列紧紧相连，载体ＤＮＡ上的同源序列与染色体靶位点发生一次同源重组，从而将整个载体整合到染色体靶位点上［４］。而置换型载体转化受体细胞，载体含有两段与基因组靶序列同源的ＤＮＡ片段，中间插入正筛选标记，一般使用的是细菌氨基糖苷磷酸转移酶基因（ｎｅｏ），可以用Ｇ４１８筛选稳定整合载体ＤＮＡ的细胞。负筛选标记是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ），用ＧＡＮＣ筛选除去随机整合了载体ＤＮＡ的细胞。以上两种载体的区别在于，载体与靶基因组同源序列双链断裂位点的不同。

２．２、细胞培养和转化。基因靶向整合在动物细胞中非常困难，以小鼠胚胎干细胞为受体细胞的有关研究显示，外源ＤＮＡ的平均转化率是５％～１０％，其中发生染色体整合的细胞仅有１％～１０％，而在这些整合外源ＤＮＡ的细胞中，同源重组的比例是１０－３，由于动物原代细胞的存活期有限，所以有效的细胞培养技术和ＤＮＡ导入技术是基因敲除实验的关键。

体外培养胚胎干细胞，其二倍体的性质能够长时间稳定保持，而且保持发育的全能性。这些特性对于作为受体细胞，接受外源ＤＮＡ并通过嵌合体途径培育基因定点整合的动物是不可缺少的。而目前有两种ＤＮＡ导入技术，一种是利用受精卵细胞内的基因同源重组，对受精卵细胞核微注射；另一种是对体外构建的同源重组或基因打靶载体进行选择鉴定，然后进行体细胞的核移植。

２．３、从细胞发育成动物个体。胚胎干细胞（ＥＳ细胞）是从早期胚胎的内细胞团分离出来的全能性细胞，在适当条件下能在体外进行增殖而保持不分化状态。将胚胎干细胞注射到囊胚腔中时，这些细胞可以和内细胞团细胞一起发育成为各种组织细胞。一般来说，早期胚胎的全能细胞混合发育而来的动物叫做嵌合体，由两种以上胚胎细胞发育而成。

基因敲除工程，首先针对某个特定的基因设计打靶载体，导入同源的胚胎干细胞中，使外源ＤＮＡ与胚胎干细胞中基因组中相应的部分发生同源重组。然后以选择性培养基筛选已发生重组的ＥＳ细胞，一般采用正负选择法，筛选出被转化的ＥＳ细胞。将这样筛选出来的遗传上修饰了的胚胎干细胞注入小鼠囊胚，再将此囊胚植入代孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠，这样的嵌合动物是带有一条正常染色体和一条突变染色体的杂合子。通过进一步繁殖这些杂合子，就可以获得靶基因座上纯合的小鼠。

3、展望

基因敲除技术是在ＤＮＡ水平上对生物基因组进行改造，可以使外源ＤＮＡ过量表达，通过同源重组将外源基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点，达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。同时也是基因工程中的一个重大飞跃，特别

基因敲除技术

王鸿姣

（河南师范大学，　河南　新乡　４５３００７）

摘　要：基因敲除技术是功能基因组学的一个重要手段，本文主要介绍了基因敲除技术的基本原理和必要条件及未来展望。

关键词：基因敲除；同源重组；ＥＳ细胞

文章编号：ＩＳＳＮ２０９６－０７４３／２０１７－０４－００８７

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农业科技

是基因敲除动物模型的建立，为哺乳动物的生物学研究提供了一个强有力的手段，对生物学、肿瘤学、神经生物学及医学和许多疾病机理的研究等产生深远的影响。虽然目前常用的基因敲除方法都存在有一定的缺陷，但随着分子生物学的不断发展与进步，基因敲除技术将得到不断地改进和完善，也会对基因功能方面的研究做出更大的贡献。

参考文献：

［１］　ＥＶＡＮＳ　Ｍ　Ｊ．　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　［Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８１，　２９２：　１５４－１５６．［２］　ＳＭＩＴＨＩＥＳ　Ｏ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ　ｌｏｃｕｓ　ｂｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　［Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８５，　３１７：　２３０－２３４．

［３］　ＡＭＳＴＥＲＤＡＭ　Ａ．　Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ［Ｊ］．　Ｄｅｖ　Ｄｙｎ，　２００３，　２２８：　５２３－５３４．

［４］　黄敏．　基因敲除技术及其应用［Ｊ］．广东轻工职业技术学院学报，　２００９，　８（４）：１１－１４．

作者简介：王鸿姣（１９９５．９－），女，汉族，河南焦作人，河南师范大学２０１４级生物工程专业在读本科生

（上接第91页）

术：我国现有的农业技术推广体系，建成于上世纪末，在基层的农业技术推广从业人员，大多来源于当时的农业技术学校或学院，参加工作以后，基本是技术工作与行政工作一起抓，更多的人是以行政工作为主，基本不直接从事实际的农业生产，这样，就导致其农业技术不能得到更新，操作技术更是裹足不前，偶尔参加技术提升培训，也是勉强应付，根本原因是：他想通过自己的认真学习来提升自己的价值基本不可能：技术推广中，行政级别高的说了算，而不是技术知识丰富的人说了算，这处技术无用论导致技术人员学习缺乏动力，知识越来越老化，基本成为摆设。

８．农业类大专院校不再培养高端农业技术人员，技术需求出现断层：大中专毕业生的工作分配制度取消后，对农业大专院校的影响是最大的，因为靠一张农业大学的文凭到市场上就业简直是痴人说梦，这导致二十多年来，农业大中专院校纷纷寻找新的生存机会：农业中专学校改制成非农业职业技术学院，农业大学则把名称保留，而开设专业内容基本不涉及农业，涉及农业的也不

以农业技术为主，而以农业环境、农业贸易、农业旅游、农业开发为主，这样，二十多年来，国家没有通过学校向社会提供农业技术人员，导致现在官方的农业技术推广人员，年龄基本都在五十岁左右，面临退休的人员更多，这种技术人员的老龄化，严重削弱了农业技术推广的能力，即使这些老龄的农业技术人员，在基层也是受乡镇政府的直接领导，从事更多的是行政工作，农业技术推广后继乏人，使当前农业技术推广体系面临解体的风险。参考文献：

［１］高启杰。农业技术推广学，中国农业大学出版社［２］高启杰。推广理论与方法，中国农业大学网络教育学院。

（上接第92页）

害物质不存在，是纯粹的绿色菜。另外一个是春天正是万物复苏、春草发芽的时候，韭菜质嫩味鲜，口感非同凡响。农谚有“春食韭则香，夏食韭则臭”，就像春天的香菜是香的夏天的香菜是臭的一样，这农谚足以说明春天的韭菜最好吃。同时，经过一个冬天的营养储存，“厚积薄发”，经过一个冬天的“养精蓄锐、整装待命”，韭菜积聚了能量，增加了养分，春天刚好派上用场，　废旧血液需要淘汰，新鲜血液需要产生，这种代谢需要肝脏来完成，而春季在五脏属肝脏，因此，春天养肝正当时，韭菜又是养肝佳品，多吃韭菜对身体大有裨益。

参考文献：

［１］百度知道　《农历、阴历、夏历的区别》［２］爱问知识人　《我国韭菜生产的历史有多久》［３］百度知道　《鸡蛋的营养价值及功效》