小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代

小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]

很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。看来做小鼠MSC的战友越来越多。一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。

其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。

欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。

提纲

一，简版

主要步骤及操作要点。

二，完整版

1. 试剂及材料准备

2. 动物手术及取材

3. 原代细胞培养

4. 细胞传代

5. 讨论

时间关系，今天先给个简版。

我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹

1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器

2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶

3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代

4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢

5. 讨论:没经验

欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教

羽之无限版主,能有空再讲讲吗

这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代

真是天天盼着你啊

呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。

……呵呵，跑题了。

我上周拍了一套取BMC的全过程照片，本来打算抽空上传的，可是……

哎！

不知道你现在用的是什么培养液？

哦，是原代啊！千万别等铺满啊，等不到的，再等细胞就都漂起来了～

原代一般你看细胞集落内部非常密集了就可以传代了！！用Stemcell公司的产品可能在10天左右就该传了，如果用普通培养液，根据血清的效果，可能时间长个几天，但2周也该传了！主要目的是把细胞打散，可以2盘传到1盘里去，接种密度控制在1-2×10^5cells/cm.cm，密度宜高不宜低！

祝好运！

xjqhy0348 wrote:

羽之无限版主,能有空再讲讲吗

这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代

真是天天盼着你啊

不知道你在42天里都采取了什么措施没有？

这么长时间不长如果期间没有在原瓶里重新贴壁处理的话很可能会导致

干细胞分化。

另外细胞状态不好是不是和PH有关？换下培养液试试？

不是高手，路过愿与各位探讨一下。

没什么不好意思的,应该不好意思的是我,缠着问你,能理我已经很高兴了,

情况就是这样,我老等铺满,培养基是DMEM．明白了我再这样做一下，成功后向你报喜．由我来替你终结完整版，到时你再修改

题外话，都象你这样，以后中国肯定很强大，谢谢你羽之无限版主

年轻的海岸，你好，我的细胞也是一周前开始状态欠佳的，自己分析不是ＰＨ的原因，可能是未添加谷胺酰胺，４２天内，每３－４天换也液一次．你说的有可能，我看到了怀疑是脂肪细胞，仅仅是猜测．望以后多多指点．按羽之无限版主说的，明天就去传代，看看行不行

flamerking wrote:

呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。

……呵呵，跑题了。

我上周拍了一套取BMC的全过程照片，本来打算抽空上传的，可是……哎！

不知道你现在用的是什么培养液？

哦，是原代啊！千万别等铺满啊，等不到的，再等细胞就都漂起来了～原代一般你看细胞集落内部非常密集了就可以传代了！！用Stemcell公司

的产品可能在10天左右就该传了，如果用普通培养液，根据血清的效果，可能时间长个几天，但2周也该传了！主要目的是把细胞打散，可以2盘传到1盘里去，接种密度控制在1-2×10^5cells/cm.cm，密度宜高不宜低！

祝好运！

2盘传一盘啊？

我以前都是一瓶传两瓶

这样是不是密度太低的原因

反正传代后长的非常慢

干细胞有这个脾气，如果少了，它也不长，所以最好2传3，这样传，要是长得慢不妨原瓶传代，防止时间长了干细胞分化。

我也是这样,感觉第一次至多要1传1,以后可能快一点

恩，这次试试一传一

再给大家报告一下结果

斑竹，支持你！有空教我，我就住在你2001年待过的campus！

flamerking 版主的方法不错，可是能否把消化的方法也整理一下？

小鼠骨髓干细胞贴壁非常牢固，不知道怎么消化下来

本人每10cm盘用1只4-6W昆明小鼠下肢的2个股骨的骨髓，用全骨髓法贴壁，10％PAA FBS，约2周长满。

细胞消化液：Gibco的0.25%胰蛋白酶,1mmol/L EDTA（事先37℃预热），吸干培养液后用PBS洗了3遍，每10cm盘加1ml消化液，于37℃培养箱消化10分钟后，只有小部分细胞脱落，其余贴壁的依然为梭形、多边形和圆形。用等量含血清的培养液终止，吹打细胞，仍旧贴的很牢。

我养人的BMSSC，用1ml上述消化液，37℃5min，细胞都成片脱落了。消化时间过长会对细胞产生伤害，请问有没有更好的消化方法？谢谢！

胰酶浓度应该够了啊，况且还加了EDTA

请问你的细胞原代已经长了几天？

若都完全铺满，恐怕消化效果就不是很好了

我的原代一般6天左右铺满80％左右，就可以传代了

只使用0.16％的胰酶消化，2min，37度后大部分细胞间隙增宽，开始变圆少部分已经开始脱落

马上加培养基终止消化液的作用

用吸管吹打，可以把90%的细胞吹下来

少数细胞仍然贴在瓶底，形态仍然为三角形

这些细胞是MSC的可能性不大，建议放弃

但传代后的细胞生长速度真是太慢了！

若消化10min，恐怕对细胞损伤很大