13种食用菌子实体(发酵液)胞外酶活力测定

13种食用菌子实体（发酵液）胞外酶活力测定

胞外酶：淀粉酶，羧甲基纤维素酶（CMC 酶），半纤维素酶（HC酶），果胶酶，漆酶测定，木聚糖酶，多酚氧化酶，蛋白酶，β-葡萄糖苷酶，脂肪酶，明胶酶，磷脂酶，溶血能力。

粗酶液的制备：在菌丝生长发育的不同阶段，从三个桶中取发菌料充分混匀然后取其20g 加蒸馏水100mL 20℃浸提4h过滤后4000r/min离心5min上清液即为粗酶液

DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）制备：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100 mL 0.2 g/mL的NaOH 溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明（在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.5 g和无水亚硫酸钠2.5 g。继续45℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1,000 mL。室温下避光保存7d 后即可使用。

蛋白质测定：取0.1mL粗酶液，加入5mL考马斯亮蓝溶液，混匀后，于595nm 处测OD值，做3个平行，求平均值，以牛血清白蛋白为对照品做标准曲线（X：蛋白含量，Y：OD值）。

还原糖测定：取稀释10倍的粗酶液1.1 ml，加3ml DNS试剂，煮沸10 min，取出冷却后加入蒸馏水16.4ml，550nm处OD值。

1、淀粉酶活力测定：1%可溶性淀粉（用0.1mol/L pH4.6 的醋酸缓冲液配制）1.9mL，粗酶液0.1mL，50℃水浴保温30min后，立即加入DNS试剂1.5mL，煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至30mL，500nm测OD值。以加热灭活的粗酶液作对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量使OD600值改变0.01为一个活力单位。（葡糖糖为对照品做标准曲线（X：葡萄糖含量，Y：OD值）。按葡萄糖标准曲线，计算可溶性淀粉被淀粉酶分解的葡萄糖含量，1 个酶活单位定义为每分钟生成1µmol 葡萄糖所需要的酶量）。

2、羧甲基纤维素酶活力（CMC 酶）测定：1% CMC-Na溶液（用0.1mol/L pH4.6的醋酸缓冲液配制）1.9mL，粗酶液0.lmL，40℃水浴保温30min后，立即加入DNS 试剂1.5mL，煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至30mL，500nm测OD 值。以加热灭活的粗酶液作对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量使OD600值改变0.01为一个活力单位。（按葡萄糖标准曲线，计算CMC-Na被羧甲基纤维素酶分解的葡萄糖含量，1个酶活单位定义为每分钟生成1µmol葡萄糖所需要的酶量）。

3、半纤维素酶活力（HC酶）测定：1% 木糖溶液（用0.1mol/L pH4.6的醋酸缓冲液配制）1.9mL，粗酶液0.lmL，40℃水浴保温30min后，立即加入DNS 试

剂1.5mL，煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至30mL，500nm测OD值。以加热灭活的粗酶液作对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量使OD600值改变0.01为一个活力单位。

4、果胶酶活力测定：1% 果胶溶液（用0.1mol/LpH4.6 的醋酸缓冲液配制）1.9mL，粗酶液0.1mL，40℃水浴保温30min后，立即加入DNS试剂1.5mL，煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至30mL，500nm测OD值。以加热灭活的粗酶液作为对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量使OD600值改变0.01为一个活力单位。（按半乳糖醛酸标准曲线，计算果胶被果胶酶分解的半乳糖醛酸含量，1个酶活单位定义为每分钟生成1µmol 半乳糖醛酸所需要的酶量）。

5、漆酶测定：采用ABTS法。2.5mL酶活反应体系中，含lmL 0.5mmol/L的ABTS，1mL pH4.0 0.2mol/L Na2HPO4-C6H8O7缓冲液和0.5mL粗酶液。先将底物和缓冲液混匀，再加入酶液启动反应，每隔1min记录600nm处OD值的变化。以加热灭活的粗酶液作对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量每分钟使OD600值改变0.01为一个活力单位

6、木聚糖酶活力测定：在试管中加入2%的木聚糖溶液(用PH4.8, 0.2 M乙酸盐缓冲液配制) 1ml，加稀释100倍的粗酶液0.1ml，50℃水浴保温10min，再加入DNS试剂3ml，煮沸10min，取出冷却后加蒸馏水16.4ml，用721分光光度计测500nm波长处OD值。以加热灭活的粗酶液作对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量使OD600值改变0.01为一个活力单位。

7、多酚氧化酶测定：5.4 mL 0.2 mol/L pH值为6.8的磷酸缓冲溶液，0.4 mL 0.02 mol/L邻苯二酚溶液，0.2 mL酶液；在30 ℃恒温水浴中进行酶促反应15 min，冷却后于420 nm波长测定OD值，做三组，求平均值。以加热灭活的粗酶液作对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量使OD600值改变0.01为一个活力单位。

8、蛋白酶活测定：取0.9 mL 0.5 %的酪蛋白(预热至30℃)于试管中，加入0.5mL 酶液摇匀，30℃保温10 mi n，加入1 mL 10%三氯乙酸，摇匀，静置，过滤，取0.5 mL 滤液，加3 mL，0.55 mol/L Na2CO3，0.5 mL福林-酚试剂摇匀，30 ℃保温15 min，于650 nm波长测定OD值。以加热灭活的粗酶液作对照。酶活力单位为1g干培养物中的酶量使OD600值改变0.01为一个活力单位。

9、β-葡萄糖苷酶酶活测定：取10ml 1%的水杨苷（溶于0.15mol/L pH 4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液）和粗酶液1.0ml于试管中混合反应0min，15min后取出1.0ml反应液立即放入1.0ml DNS试剂终止反应充分混合后在沸水浴加热5 min，迅速冷却至室温加水定容至10ml分别取0min，15min时的反应液立即测定520nm 波长下的吸光值OD1和OD2。以加热灭活的粗酶液作对照。则OD值增量为OD ＝OD2-OD1。

10、脂肪酶酶活测定：0.5ml粗酶液加入到pNPP底物溶液中37 ℃反应30min 生成对硝基苯。测定反应前后反应液在410nm处吸光度值。以加热灭活的粗酶液作对照。每分钟产生1mol对硝基苯所需的脂肪酶量为1个酶活力单位。