贝类体液免疫机制的研究进展_黄硕芩

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福建轻纺 ２０１１年６月第６期
论文
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１ 贝类体液免疫机制的研究材料
目前用于贝类免疫机制研究的材料有：美 洲牡蛎 （Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ） 、长牡蛎
（Ｃ． ｇｉｇａｓ） 、丽文蛤 （Ｍｅｒｅｔｒｉｘ ｌｕｓｏｒｉａ） 、 褶牡蛎 （Ｏｓｔｒｅａ ｐｌｉｃａｔｕｌａ） 、虾夷扇贝 （Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ） 、贻贝 （Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ） 、栉孔扇贝 （Ｃｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉ） 、巨 大石房蛤（Ｓａｘｉｄｏｍｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ） 、栉江珧 （Ｐｉｎｎａ ｐｅｃｔｉｎａｔａ） 、杂色蛤仔（Ｒｕｄｉｔａｐｅｓ ｖａｒｉｅｇａｔａ）、杂色鲍（Ｈａｌｉｏｔｉｓ ｄｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、 长砗磲 （Ｔｒｉｄａｃｎａ ｍａｘｉｍａ） 、非洲大蜗牛 （Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）、河蚬（Ｃｏｒｂｉｃｕｌａ ｆｌｕｍｉｎｅａ）等。这些贝类大多是重要的养殖贝 类，研究这些贝类的免疫机制对水产养殖防病控 病等具有重要的意义。例如： Ｓｔａｕｂｅｒ 等人利 用美洲牡蛎 （Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ）进行研 究， Ｃｈｅｎｇ Ｔ Ｃ 等［２］对美国东部的牡蛎和硬壳蛤 进行研究。
贝类体液防御的第一道重要防线就是抗菌 肽，当机体受到病原微生物入侵时，其分泌到细 胞表面，直接起抗菌作用。当前贝类抗菌肽的研 究主要集中于贻贝，当贝类受到病原刺激时，抗 菌肽能够迅速表达，同时进行全身分布。根据各 种抗菌肽化学性质的不同，Ｍｉｔｔａ Ｇ等［９］把从贻贝 中分离纯化得到的抗菌肽分为：贻贝肽、贻贝 素、防御素和贻贝霉素。防御素作为当前抗菌肽 中研究最多的一种，了解到其具有杀伤微生物细 胞和生长旺盛的癌细胞的功能。当前已经被分离 纯化的防御素的主要特点是：具有富含半胱氨 酸、阳离子、小分子质量，同时又是有特定抗菌 活性的一类抗菌肽。根据已知的结构，分离纯化 的 防 御 素 又 可 以 分 为 贻 贝 防 御 素 、 Ｍｙｔｉｃｉｎｓ、 Ｍｙｔｉｌｉｎｓ 和Ｍｙｔｉｎｙｃｉｎ［１０］ 。这些防御素在不同 的贻贝中起特定的抗菌功能。 ３．３ 溶酶体酶
３ 免疫机制
贝类的免疫应答要依赖两大类反应：（１） 细胞免疫，主要是血细胞对入侵微生物的吞噬包 围作用；（２）体液免疫。以下重点介绍参与体 液免疫的活性因子，主要包括：凝集素、抗菌 肽、溶酶体酶等。 ３．１ 凝集素
在贝类体内中广泛存在着凝集素，凝集素是
一类非特异性免疫的多价构型的蛋白质或者糖蛋 白，具有多种功能：第一、能够对入侵到机体内 的异源物质进行免疫应答 ［４］。第二、有些贝类血 淋巴细胞的表面含有凝集素受体，通过与凝集素 结合，利用其具有的识别、粘附异物的作用，促 进血淋巴细胞的吞噬效果 。 ［５－１７］ 凝集素具有的特 异性地识别细胞表面糖残基的功能，能被不同的 糖 类 抑 制 ， 其 表 现 在 泥 蚶 （Ｔｅｇｉｌｌａｒｃａ ｇｒａｎｏｓａ）凝集素的活性能被乳糖和半乳糖抑制［６］ 。 第三、贝类蛋白腺和卵细胞表面都有凝集素表达 ［５］，使得贝类的精卵细胞可能利用凝集素作为桥 梁实现彼此间的相互识别、粘附，最终完成受精 过程 。第 ［８－１８］ 四、激活免疫系统的溶血功能。第 五、传递糖类物质，建立共生关系。 ３．２ 抗菌肽
４ 展望
科学研究者对贝类体液免疫机制的研究已进 展了一段时间，并获得了较全面的了解。例如： 非洲大蜗牛头足部和内脏团的抗菌活性物质及化 学成分分析［１９］、贻贝抗菌肽的研究进展［２０］、东海 贻贝抗菌肽Ｍｙｔｉｃｉｎ Ａ基因的克隆表达及其生物 学活性等都对贝类抗菌活性［２１］进行了较深入的探 索研究。贝类免疫机制的研究对于研究水产养殖 中病害的防治具有重要意义。针对当前养殖业中 过量使用抗生素这一问题，我们可以根据贝类免 疫机制的研究开发出一种新的免疫增强剂，免疫 增强剂的应用，将大大激活贝类的非特异性免疫 功能，普遍提高其防病抗病能力，对养殖业、环 境保护、水产品卫生安全均具有重要意义［７］。另 外，异源免疫效应基因的研究和单克隆抗体的研 究也为贝类免疫生物学研究提供了新的手段，使 之呈现出更广泛的应用前景［２２］。总而言之，贝类 免疫机制的研究任重而道远，其具有广阔的研究 前景。
伴随着贝类的免疫研究的不断深化，化学递 质作为一个全新的研究领域正在被越来越多的研 究者所关注。贝类的化学递质存在于贝类的体液 和血细胞中，包括细胞因子 （ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、促肾 上 腺 皮 质 素 释 放 素 （ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐ－ｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、 阿 片 样 活 性 肽 （ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐ－ ｔｉｄｅｓ）、糖皮质素（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）和蛋白激 酶 （ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＰＫ）等化学活性物质［１５］ 。 阿片样活性肽通过改变免疫细胞的形态来参与贝 类免疫。Ｈｕｇｈｅｓ Ｔ Ｋ等［１６］向贻贝的血淋巴加阿片 肽时发现，免疫细胞变扁，产生趋化性，促进了 吞噬作用。
［１３］ Ｃｈｅｎｇ， Ｔ Ｃ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｍｏｌｌｕｓｃａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｓｍｅｒ Ｚｏｏｌ．１９８３， ６（６）：４０３－４１２．
贝类具有不同于脊椎动物的免疫机制，这些 免疫机制在传统上被分为细胞免疫和体液免疫 ［１］。有关贝类的免疫机制的研究约有上百年的历 史了，从最初的贝类体内参与细胞免疫的血细胞 结构功能的研究以及参与体液免疫的各种因子的 发现和分离，发展到当前进入探索不同种免疫因 子相互作用的阶段，各种化学递质介导的有关免 疫信号传导的研究。文章将从研究材料、研究方 法（包括粗体物的提取和抗菌活性物质分离纯化 程度），着重对贝类的体液免疫机制中的凝集 素、抗菌肽、溶酶体酶、化学递质４种活性因子 的研究进展予以综述。
论文
黄硕芩：贝类体液免疫机制的研究进展
贝类体液免疫机制的研究进展
黄硕芩 （福建师范大学生命科学学院，福建 福州 ３５０１０８）
摘 要 ：贝类作为无脊椎动物，体内不存在特异性免疫细胞和相应的抗体，但是贝类可以通过一些异于脊椎动 物的独特免疫机制来抵抗外界病原体的侵入同时能够进行异己物质的识别，贝类的这种免疫机制可以分为细胞免 疫与体液免疫。因此，对贝类的免疫机制的研究不仅有利于提高其自身的抗病能力，也对高等动物免疫机制的研 究具有重要的理论和实际意义。 关键词：贝类；体液免疫 ；研究进展 ｄｏｉ： １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－５５０Ｘ．２０１１－０６－００５ 中图分类号：Ｑ９５４．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－５５０Ｘ（２０１１）０６－００４２－０４
贝类的颗粒细胞的溶酶体中主要含有：酸性 磷 酸 酶 （ＡＣＰ）、 碱 性 磷 酸 酶 （ＡＫＰ）、 溶 菌 酶 （ＬＳＺ）、氨肽酶 （ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、β－葡萄糖
论文
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甘 酸 酶 （β －ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、 脂 肪 酶 （ｌｉｐａｓｅ）等溶酶体酶。当细胞进行吞噬作用时， 这些酶通过颗粒作用释放到血清中发挥作用［１１］。
收稿日期：２０１１－０３－２４ 作者简介：黄硕芩（１９８４－），女，福建泉州人，研究生，研究方向：动物生态学。
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２ 贝类体液免疫机制的研究方法
在贝类的体液内含有多种抗菌活性物质， 为了区分是否具有抗菌活性和检测其抗菌活性 大小，科学家通过研究总结出了多种检测方 法。例如：采用滤纸片药剂扩散抑菌法 。 ［３］ 首 先，需要制备一定浓度的各种供试菌悬液（细菌 １×１０６个·ｍＬ－１）。再将各种供试菌悬液分别倒入 温度约为４０－４５℃融化的培养基当中，充分混合 均匀。接着分别将各混合液迅速的分装到不同培 养皿（φ＝９０ ｍｍ），每个培养皿中培养基的厚度一 般为４－５ ｍｍ为宜。待培养基冷却凝固后，取已经 消毒过的圆形小纸片（φ＝６ｍｍ），每２片为一组 将他们重叠在一起，分别用移液枪滴加各种提取 液，等溶剂挥发之后，用镊子将滤纸片夹入培养 基平板上，
［１２］ Ｃｈｅｎｇ Ｔ Ｃ， Ｒｏｄｉｃｋ Ｇ Ｅ， Ｆｏｌｅｙ Ｄ Ａ． Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｈｅｍｏｌｙｍ ｐｈ ｃｈｅｌｌ ｏｆ Ｍｅｒｃｅｎａｒｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ［Ｊ］． Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９７５（ ２５）：２６１－２６５．
并且每一个培养皿相对应的要做一对照组实 验。最后将培养皿置于恒温恒湿的培养箱中在 ３７℃条件下培养１８ ｈ，然后取出，使用十字交叉 法测量出抑菌圈的直径。根据抑菌圈的直径的大 小判断提取物质的抗菌活性。
对于脂类物质，可以使用硅胶层析、薄层层 析分离粗提物，采用气相色谱－质谱法（ＧＣ－ＭＳ） 分析化学成分；对于蛋白质物质，可以采用硫酸 铵分级反抽、离子筛层析、吸附层析、分子筛层 析等进行分离纯化，并对纯化物质进行凝胶电泳 等方法进行纯度验证。
溶菌酶不仅可以使病原体细胞壁溶解，还能部 分或者完全抑制其存活或正常发育。Ｃｈｅｎｇ［１２－１３］研究 发现溶菌酶在贝类的炎症反应中起核心作用。刘 世良等［１４］报道指出溶菌酶能够溶解病原体的细胞 壁，并且部分或者全部抑制病原菌的生长与繁 殖。
此外，溶酶体中的氨基肽酶、脂肪酶等水解 酶不仅能够直接起抗菌作用，还可以作为调节因 子调节细胞的吞噬。 ３．４ 化学递质
酸性磷酸酶可以将吞入细胞的异物逐步消化 分解，其反应机制是：酸性磷酸酶能够催化有机 磷酸酯水解，打开磷酸酯键，将磷酸酯根离子释 放，进而破坏细菌的细胞壁。
碱性磷酸酶通过改变细菌表面的结构来增强 细菌的异己性，可以加速吞噬细胞的吞噬作用和 异物的降解速度。同时，碱性磷酸酶还参与膜的 吸收和转运、钙离子的吸收和维持细胞内磷酸浓 度。