军团菌及其检测方法

武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
培养检测所需准备材料
1. 直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿
2. 培养箱，CO2能够恒温保持在（36±1）℃。
3. 水浴箱，能够保持在（50±1）℃
4. 显微镜或荧光显微镜。
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样品采样准备材料
1. 玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集 为250-500ml，收集在容器瓶中。 2. 如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热 水（不低于70℃）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于 5分钟。 3. 小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。 4. 广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。 5. 灭菌棉拭子。 一般建议用塑料包装的容器
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标本
肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸 水、胸腔引流物
水样 水样处理与制备 接种军团菌选择性 GVPC培养基
尿液 抗原 检测
血清 血清学检测方法： *间接荧光抗体染色法 *试管凝集试验 *ELISA法
接种军团菌BCYE培养基
37℃，5%CO2，培养3-14天 挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检
1985
1985 1986 1988 1989
Legionella worsleiensis
Legionella lansingensis Legionella lytica Legionella waltersii Legionella taurinensis Legionella beliardensis Legionella drozanskii Legionella fallonii Legionella gresilensis Legionella rowbothamii Legionella busanensis Legionella drancourtii

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军团菌种
种名 Legionella pneumophila Legionella bozemanae Legionella dumoffii Legionella gormanii
发现时间
1979 1980 1980 1980
种名 Legionella maceachernii Legionella parisiensis Legionella rubrilucens Legionella santicrucis
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Part I：军团菌及军团菌病
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军团菌
• 革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径 0.3～0.5μm，长约1.2～5μm或更长， 菌体一端有鞭毛. 在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼 脂培养基上生长，通常需要在37℃
•
5%CO2培养箱培养2-10天。
军团菌及其检测技术
武汉市疾病预防控制中心
微生物检验科 赵滢 博士
EMAIL ： hustzy401@foxmail.com
2014 年 11 月
军团菌的发现
1976年7月在美国费城，参加退伍军人大会的人员中
爆发了一种症状相同，原因不明的细菌性肺炎， 有 221人感染疾病，其中死亡34人。 初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通过空 气传播，采集标本，分离病原体 革兰氏阴性杆菌——嗜肺军团菌（L. pneumophila ） 军团菌病 (已知的首次爆发)
37℃,5%CO2, 培养3-14天
革兰氏染色阴 性杆菌
革兰氏染色阳 性杆菌
纯培养
弃去
确认试验
生化试验
血清玻片凝集试验
PCR检测
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军团菌水质检测概括
1. 采样 2. 浓缩 3. 培养
4. 分离
5. 鉴定
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实验所需仪器设备
90mm平皿 35~37孵箱 滤器（大的不锈钢制成的滤器） 正压膜蠕动过滤泵：流速可调。3升/分钟 注意：样本量少，也可用真空辅助的滤过系统代替 膜滤器：0.22um或0.45um 水浴锅：
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标本的运输和相关生物安全要求
在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止
受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实 验室,室温下(21+3℃)贮藏在实验室或其他地方。
对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进 行，应放在-20℃冻存备用。
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Leabharlann Baidu
军团菌病
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Part II：样本的采集与运输
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哪些环境中存在军团菌？
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标本的种类
环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。
军团菌操作生物安全性
应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全Ⅱ级实验室，最好在安全柜中操作。
操作人员培训。
菌种保存。
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《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒） 种或样本运输管理规定》
病原菌名称 学名 Legionella pneumophila 中文名 嗜肺军团 菌 危害程度 分类 实验活动所需生物安全实验室级别 大量活菌 动物感 操作 染实验 BSL-2 ABSL-2 样本 检测 BSL-2 非感染性 材料实验 BSL-1 运输包装分类 A/B UN 编 号 UN 3373
杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室。不知来
源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。
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常见几种系统采集部位
冷水系统的采集： • 进水系统 • 蓄水池
• 与每个蓄水池相连的下水道的排出口
• 蓄水池最远的下水道的排出口 对每一个装置来说，收集500ML最初流出的水标本，让水持续 流，并在流水中放一只温度计，待温度稳定后，收集500ML过 后流出的水标本。
的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。
• 在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用 吸取顶部蓄水池的水。先用水充满管子并夹住其一端，以防止
管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在采样瓶里，使
瓶内管的一端低于蓄水池管的一端。松开夹子，水开始流出， 取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出。
离心机：
涡旋振荡器： 显微镜：
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军团菌检测所需准备基本试 剂
1. 培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS)
2. 试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液） 3. 酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液 （0.03mol/L KOH） 4. 血清学试剂
1993
1994 1996 1996 1999 2001 2001 2001 2001 2001 2003 2004
1983 1984 1984 1985 1985 1985 1985 1985
1989 1989 1990 1990 1991 1991 1991 1992
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• 进水口远处采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池
塘表浅部位的粘泥（深度<20cm)，用虹吸管采取池 子深处的粘泥。采集位于该系统内滤器的水，沉淀物， 碎砾等。 • 注意：所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理 位置。如果蓄水池和水塔之间的管道短，那么只需采 集一份标本。
发现时间
1985 1985 1985 1985
种名 Legionella geestiana Legionella londiniensis Legionella nautarum Legionella quateirensis
发现时间
1993 1993 1993 1993
Legionella micdadei
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热水系统 • 加热器的排出口：选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备
• 关掉离加热器最近的冷水系统。
• 避免冷热水混合
• 加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥
• 排水口连接一根干净的硅胶管 采样方式：打开开关采集最初流出的水标本。让水排掉至温度 稳定为止。再采一份过后流出的标本，并关闭开关
• 生长形成的菌落一般呈白色，也可能 会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。
初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为 刻花玻璃样，具有多型性.
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军团菌科、属、种、血清型
军团菌科 (Legionellaceae ）
Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei
1980
1980 1982 1982 1983
Legionella spiritensis
Legionella steigerwaltii Legionella israelensis Legionella birminghamensis Legionella brunensis Legionella cincinnatiensis Legionella moravica Legionella quinlivanii Legionella tucsonensis Legionella adelaidensis Legionella fairfieldensis Legionella gratiana Legionella shakespearei
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淋浴器
• 收集最初流出的水标本 • 如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴，用一个干净的 未用过的塑料袋，该装置包裹起来，切掉一个角，将 该切口处置于接取标本容器的开口处
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冷却塔
• 警告：为安全起见，采样前，负责供水系统的工作人员应关掉 冷却塔的鼓风机。戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于 机器继续运行而不能关闭冷却塔时，则需要采样人员做出专门
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环境标本采集原则
最初流出的水标本：打开水龙头或装置后立即采集水
样，该水样即代表设备内的水。 过后流出的水标本：最初流出的水标本收集以后，让 设备内的水流掉后再采集水样。此水代表供给设备的 水。
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环境标本采集
• 有杀生物剂时的采样：水样中含有氯或其它氧化性杀 生物剂时，向采样瓶中添加适量硫代硫酸钾使其灭活。 对于其它的生物剂，加入普通的中性试剂是无效的。 • 注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的 间隔时间控制在14天以内。样本的来源，数量，有无
第三类
B
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Part III：军团菌的分离与检测
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水样标本中军团菌的分离方法
检测依据:
《公共场所集中空调通风系统卫 生规范》中的集中空调通风系 统冷却水、冷凝水中嗜肺军团 菌的检验方法见附录B。 适用于各种环境标本军团菌检 测 ，包括： 饮用水、工业用 水、天然水以及一些如沉积物、 沉淀物、软泥等物质。
军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系γ亚群中， 军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细 胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。 军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型 （serogroups)，至少有20个种可引起人感染。
Legionella pittsburghensis Legionella jordanis Legionella longbeachae Legionella oakridgensis Legionella wadsworthii Legionella feeleii Legionella sainthelensi Legionella anisa Legionella cherrii Legionella erythra Legionella hackeliae Legionella jamestowniensis