血流感染分子诊断的研究进展

分析患者的血液标本， 快速提供准确的细菌、 真菌 或病毒感染信息， 甚至提供常见致病菌的耐药基 因检测结果， 指导临床医生及时、 准确地使用抗菌
03 ） 基金项目： 浦东新区卫生系统重点专科建设（ PWZz 2013作者简介： 郭 1983 年生， 建， 男， 硕士， 技师， 主要从事病原微生物快速诊断及耐药性研究。 20334503 。 通讯作者： 吴文娟， 联系电话： 021-
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对 2005
至 2007 年挪威的 113 例不动杆菌属血流感染患 者研究发现， 使用 PCＲ 方法可以快速检测血培养 阳性瓶中的鲍曼不动杆菌等。对于碳青霉烯类常 有助于早 见的耐药突变基因 bla OXA-51-like 进行测序， 期报告耐药菌以提示临床合理用药 。对全麻拔牙 患者的血流感染风险研究显示， 使用通用引物检 测全血标本中的 16 S rＲNA， 结合焦磷酸测序技术 可以很好的发现草绿色链球菌等， 对于评估血流 感染有重要意义
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； 二是使用通用引物扩增检测细
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26 S rＲNA 等基 菌 16 S rＲNA 和真菌 ITS 及 5 ． 8 S、 因 D1 / D2 序列， 同时进行测序分析 。 检测特异性目标基因需要合成相关病原微生 核酸扩增反 物的特异性引物或购买有关试剂盒， 应体系条件不尽相同。Sidor 等
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对布 研究发现，
鲁菌 bcsp31 基因设计特异性引物， 可以通过 PCＲ 的方式快速检测血液、 组织等标本中的布鲁菌， 敏 感性和特异性分别达到 70． 4% 和98． 3% 。 Springer 等［9］通过 PCＲ 的方法检测了 803 例 侵袭性曲霉病患者的全血和血清标本中的曲霉菌 ITS1 5 ． 8 S rＲNA 后发现， 全血标本中曲霉菌检测 阳性率可达到 85% ， 略好于血清标本的 79% 。 使 用通用引物扩增检测细菌 16 S rＲNA 基因， 再进行 基因序列测定、 计算机分析和比对， 最终鉴定病原 微生物， 其核酸扩增反应体系条件较易掌控 ， 应用 范围广， 可以发现新的菌种。 Karah 等
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FISH 的 基 础 上， 使用葡 在 Quick-
FISH） 萄球菌快速检测技术（ Staphylococcus Quick可以在 30 min 内快速鉴定金黄色葡萄球菌和凝 固酶阴性葡萄球菌， 其检测敏感性达到 99． 5% 和 98． 8% 。 QuickFISH 检 测 技 术 与 聚 合 酶 链 反 应 （ polymerase chain reaction ， PCＲ） 联合使用时优势 更加明显
血流感染（ blood stream infection） 是一种严重 的全身感染性疾病， 其中仅有 30% 40% 的血流
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足临床早期、 快速诊断以指导治疗的需要。 同时 也不适合临床实验室对不易培养的微生物的及时 检出， 如军团菌属 （ Legionella spp． ） 、 巴尔通氏体 属 （ Bartonella spp． ） 和 曲 霉 属 真 菌 （ Aspergillus spp． ） 等［1］。分子生物学检测技术的发展旨在增 加病原体检测的敏感性和特异性， 扩大检测的病 原谱， 缩短检测时间， 减少抗菌药物对病原体检测 的抑制作用
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已成为分子生物学及其相关领域的经典试验方 法， 由 PCＲ 演变的相关核酸扩增技术也逐步在临 床微生物学检验领域得到应用。 PCＲ 在血流感 染微生物检测和鉴定中的应用体现在 3 个方面： 一是对分纯的病原菌鉴定； 二是对血培养阳性培 养物快速鉴定； 三是对临床标本中难以培养病原 菌进行检测和鉴定。可通过 2 种方式检测和鉴定 病原微生物， 一是使用特异引物扩增检测病原微 生物目标基因
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。 在第 1 代
荧 光 原 位 杂 交 技 术 （ peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization，PNAFISH ） 的 基 础上
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， 第 2 代 荧 光 原 位 杂 交 技 术 （ quick-
fluorescent in situ hybridization，QuickFISH ） 已能 更好 地 满 足 临 床 实 验 室 对 操 作 简 便、 快速的需 求
· 584· 8640 （ 2014 ） 06058406 文章编号： 1673-
检验医学 2014 年 6 月第 29 卷第 6 期 中图分类号： Ｒ446． 5 文献标志码： A
Laboratory Medicine，June 2014 ，Vol 29． No 6．
DOI： 10． 3969 / j． issn． 16738640． 2014． 06． 002
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。 Jeng 等［12］在对血流感染病
例的 研 究 中 发 现， 使用高分辨率熔解曲线分析 （ highresolution melt analysis， HＲMA ） PCＲ 检 测 沙门菌的 16 S rＲNA 可有效地检出致病菌。
TM 由德国公司开发的 SepsiTest 检测试剂盒，
， 如检测阳性标本中金黄色葡萄球菌
Hale Waihona Puke Baidu
的 mecA 基因、 耐万古霉素基因 vanA 和 vanB 等， 快速诊断提供合理用药的重要提示对患者的预后 有重要意义。 二、 核酸扩增及 DNA 序列分析 PCＲ 是一种体外核酸扩增技术。 目前， PCＲ
采用 3 对引物特异性地扩增全血标本中致病菌的 16 S rＲNA、 18 S rＲNA 序 列， 通过测序后在线 BLAST 比对便可以准确地鉴定血流感染致病菌。 随着测序技术的不断发展和 16 S rＲNA 数据库的
检验医学 2014 年 6 月第 29 卷第 6 期
Laboratory Medicine，June 2014 ，Vol 29． No 6．
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药物进行抗感染治疗。更为理想化的结果是对全 血标本检测的同时提供感染细菌的定量等数据 ， 用于评估微生物治疗后的血液清除率 。 当前， 应用于临床实验室血流感染检测的分 子生物学技术主要包括基于病原微生物 DNA 或 ＲNA 的 检 测 技 术 如 核 酸 杂 交 （ nucleic acid hybridization） 、 核酸扩增及 DNA 序列分析、 基因 芯片和以蛋白质组学为基础的质谱检测技术等 。 一、 核酸杂交技术 核酸杂交是指具有一定互补序列的 2 条核酸 单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则形 成同源或异源双链分子的过程。 核酸杂交可在 DNA 与 DNA、 ＲNA 与 ＲNA 或 ＲNA 与 DNA 的 2 条单链之间进行。 其中， 荧光原位杂交技术应用 于临床实验室鉴定工作已有 10 余年， 其检测的敏 感性和特异性可达到 96% 100%
血流感染分子诊断的研究进展
郭 建 综述， 吴文娟 审校 （ 上海市东方医院南院医学检验科， 上海 200123 ）
摘要： 血流感染是一种严重的全身感染性疾病， 血培养仍是目前诊断细菌性血流感染的金标准， 但仅有 30% 40% 的血流感染可通过培养发现致病菌 。分子生物学方法可通过分析患者血液标本中病原微生物的核 酸成分， 快速提供准确的细菌 、 真菌或病毒感染信息， 甚至提供常见病原菌的耐药基因检测结果 。 目前， 应用于 临床实验室血流感染检测的分子生物学技术主要包括核酸杂交技术 、 核酸扩增及 DNA 序列分析、 基因芯片和质 谱检测技术等。对常见致病菌、 分枝杆菌、 苛养菌、 少见病原菌等使用多种检测技术联合应用进行快速鉴定及耐 药分析， 可以在较短时间内为临床提供可靠的诊断结果， 提示临床合理用药， 提高血流感染患者的存活率 。 关键词： 血流感染； 分子诊断； 研究进展 GUO Jian， WU Wenjuan．
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。不 同 于 美 国 研 发 的 第 1 代 PNAFISH
（ AdvanDX， MA， QuickFISH 省去 美国） 检测技术， “自我报告 ” 了杂交后的 30 min 清洗环节， 采用了 探针， 同时将杂交时间节省到了 15 min。 这将大 大提高对血培养阳性的革兰阴性细菌如大肠埃希 菌、 肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌， 以及革兰阳性 细菌如金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的 检测效率， 同时简便的操作也将更有利于该技术 的推广。 Deck 等
The research progress in the molecular diagnosis of blood stream infection
（ Department of Clinical Laboratory，South Branch，East Hospital，Shanghai 200123 ，China） Abstract： The blood stream infection is a syndrome of serious systemic infection，and blood culture remains being the gold standard for the diagnosis of bacterial blood stream infection，but only 30% 40% blood stream infection pathogens could be found by blood culture． Molecular biology method through analyzing the nucleic acid of microorganisms in blood samples will quickly provide the results of bacterial，fungal or viral infections accurately，and provide a common resistance gene detection results of pathogens． At present，the molecular diagnosis techniques for blood stream infection in clinical laboratories mainly include nucleic acid hybridization，nucleic acid amplification and DNA sequence analysis，gene chip，mass spectrometry and so on． The common pathogenic bacteria，mycobacteria， fastidious bacteria，rare pathogenic bacteria use a variety of detection techniques combined with the application of rapid identification and drug resistance analysis，which can provide reliable diagnosis results for clinical in a relatively short period of time，indicate the use of clinical rational drug and improve survival in patients with blood stream infection． Key words： Blood stream infection； Molecular diagnosis； Ｒesearch progress
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感染者可以通过培养的方式发现致病菌
。引
病毒及寄生 起血流感染的微生物包括细菌、 真菌、 虫， 阳性血培养可为临床提供病原学诊断的依据 。 血流感染初期的 24 h 内， 若未能及时进行早期诊 断以及合理的抗菌药物治疗将会导致患者存活率 大大下降
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。
。 理想的分子生物学方法可通过
虽然血培养仍然是目前诊断细菌性血流感染 的金标准， 但血培养的阳性检出率不高， 检测时间 过长（ 阳性报警需要 1 5 d， 甚至更长 ） ， 无法满