酶分子修饰ppt课件
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相 对 分 子 质 量 为 1000 ～ 10000 的 PEG 被 广 泛 应 用。
2019/9/5
15
2、修饰剂的活化
聚乙二醇修饰蛋白质主要通过聚乙二醇 的末端羟基与蛋白质的氨基酸残基反应而实现， 但聚乙二醇的末端羟基活性很差，很难在温和 的环境中与蛋白质进行偶联反应，所以必须使 用活化剂活化该羟基，使活化的聚乙二醇能在 温和的环境中对蛋白质进行共价修饰。
2019/9/5
10
金属酶：即含有金属离子的酶，金属离子在 酶中主要有结构功能和催化功能。金属酶种 类繁多，如：Fe、Zn、Cu、Mn、Mo、Co、Ni 等。金属离子在相应的金属蛋白中有一定数 目的原子参与活性，金属与邻近的非金属原 子（S、O、N等）配位一起构成辅基，并与蛋 白结合发挥出独特的催化功能，估计在全部 已知的酶中大约1/4～1/3都要求具备金属离 子的活性中心。
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21
3、修饰
将带有活化基团的大分子修饰剂与经 过分离纯化的酶液，以一定的比例混合， 在一定的温度、pH值等条件下反应一段时 间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧 链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。
4、分离
需要通过凝胶层析等方法进行分离，
将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获
得具有较好修饰效果的修饰酶。
2019/9/5
6
二、酶分子修饰的原理
酶分子是具有完整的化学结构
和空间结构的生物大分子，酶分子
的完整结构决定了酶的性质（催化
效率高，专一性强和作用条件温和
等）和生物催化功能。当酶分子的
结构发生改变时，将会引起酶的性
质和功能的改变。
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7
三、酶分子修饰的目的
①提高酶的活性； ②增强酶的稳定性； ③降低或消除酶的抗原性； ④探讨酶结构与功能之间关系。
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羟基琥珀酰亚胺活化与偶联反应原理图
生成MPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯
2019/9/5
19
③聚乙二醇马来酸酐衍生物：与马来 酸酐反应生成PM。可通过马来酸酐对酶 分子上的氨基进行修饰，形成酰胺键。 这些蜂窝巢型修饰剂在酶分子表面覆盖 上阴离子基团。
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④聚乙二醇氨类衍生物等：MPEG的羟基 与胺类化合物反应，生成的聚乙二醇胺 类衍生物，可以对酶分子上的羰基进行 修饰。
第五章 酶、细胞、 原生质体固定化
第六章 酶反应器 第七章 酶的应用
2019/9/5
3
酶的生物改造（定向进化）略 酶的化学修饰
2019/9/5
4
酶的化学修饰
基本原理 方法学 应用
2019/9/5
5
第一节 酶分子修饰的基本原理
一、酶分子修饰的概念 通过各种方法使酶分子结构
发生改变，从而改变酶的某些性质 和功能的过程，称为酶分子修饰。
近年来聚乙二醇的活化方法已成为该领 域的研究热点之一。
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例如，常用的大分子修饰剂单甲氧基聚乙二醇 （MPEG）可以采用多种不同的试剂制备聚乙二醇衍 生物：
①聚乙二醇均三嗪衍生物：MPEG的羟基与均三 嗪(三聚氯氰）可制得MPEG1和MPEG2。后者分子上的 活泼氯离子可以对天冬酰氨酶等酶分子上的氨基进 行修饰。
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二、大分子结合修饰
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使 酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与 功能的方法称为大分子结合修饰。
目前应用最为广泛的酶分子修饰方法。
（一）、大分子结合修饰的方法
1、修饰剂的选择 一般为水溶性大分子。如，聚乙二醇（PEG）、
右旋糖苷、蔗糖聚合物（ficoll）、葡聚糖、环状 糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。
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（二）、大分子修饰的作用
1、通过修饰提高酶活力
例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖苷结合， 可以使酶活力提高2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右 旋糖苷结合，酶活力达到原有活力的5.1倍。
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第二节 酶分子修饰的方法
酶分子修饰技术不断发展，修wk.baidu.com方法 多种多样。
酶分子修饰主要包括：金属离子置换 修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、 肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修 饰、氨基酸置换修饰、核苷酸置换修饰和 酶分子的物理修饰等。
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一、金属离子置换修饰
把酶分子中的金属离子换成 另一种金属离子，使酶的特性和 功能发生改变的修饰方法称为金 属离子置换修饰。
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（一）、金属离子置换修饰的方法
⑴酶的分离纯化：首先获得一定纯度的酶。
⑵除去原有的金属离子：利用螯合剂（EDTA等） 与金属离子形成螯合物，再通过透析、超滤、 分子筛层析等方法，将螯合物除去。
⑶加入置换离子：加入另一种金属离子。常用 的金属离子一般为：Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Zn2＋、 Co2＋、Cu2＋、Fe2＋等二价金属离子。
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②聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：
MPEG 的 羟 基 与 琥 珀 酰 亚 胺 反 应 ， 生 成 SS-MPEG 、 SSA － MPEG 、 SC-MPEG 等 衍 生 物 。 这些衍生物可以在pH7~10的条件下对酶分子 的氨基进行修饰。
MPEG琥珀酸亚胺碳酸酯
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第四章 酶分子修饰
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1
前言： 酶分子经过修饰以后，可以显著提
高酶的使用范围和应用价值。 酶分子修饰成为酶工程中具有重要
意义和应用前景的领域。 本章主要介绍酶分子修饰的基本原
理、方法与修饰酶的特征。
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酶工程
第一章 酶学概述 第二章 酶的生产 第三章 酶的分离纯化 第四章 酶分子修饰
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（二）、金属离子置换修饰的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响 2、提高酶的活力
例如：α－淀粉酶，是杂离子型的。 将其他的杂离子换成钙离子，则可以提高酶 活力并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型α －淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型α－ 淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大 增加。
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3、增强酶的稳定性
例如：Fe－SOD分子中的铁离子被锰离子置换， 成为Mn－SOD后，其对过氧化氢的稳定性显著增强。 对叠氮钠（NaN3）的敏感性显著降低。
4、改变酶的动力学特性
例如：用钴离子置换酰基化氨基酸水解酶的活 性中心的锌离子，其催化N－氯－乙酰丙氨酸水解的 最适pH值从8.5降低为7.0。同时该酶对N－氯－乙酰 丙氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。
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2、修饰剂的活化
聚乙二醇修饰蛋白质主要通过聚乙二醇 的末端羟基与蛋白质的氨基酸残基反应而实现， 但聚乙二醇的末端羟基活性很差，很难在温和 的环境中与蛋白质进行偶联反应，所以必须使 用活化剂活化该羟基，使活化的聚乙二醇能在 温和的环境中对蛋白质进行共价修饰。
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金属酶：即含有金属离子的酶，金属离子在 酶中主要有结构功能和催化功能。金属酶种 类繁多，如：Fe、Zn、Cu、Mn、Mo、Co、Ni 等。金属离子在相应的金属蛋白中有一定数 目的原子参与活性，金属与邻近的非金属原 子（S、O、N等）配位一起构成辅基，并与蛋 白结合发挥出独特的催化功能，估计在全部 已知的酶中大约1/4～1/3都要求具备金属离 子的活性中心。
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3、修饰
将带有活化基团的大分子修饰剂与经 过分离纯化的酶液，以一定的比例混合， 在一定的温度、pH值等条件下反应一段时 间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧 链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。
4、分离
需要通过凝胶层析等方法进行分离，
将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获
得具有较好修饰效果的修饰酶。
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二、酶分子修饰的原理
酶分子是具有完整的化学结构
和空间结构的生物大分子，酶分子
的完整结构决定了酶的性质（催化
效率高，专一性强和作用条件温和
等）和生物催化功能。当酶分子的
结构发生改变时，将会引起酶的性
质和功能的改变。
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三、酶分子修饰的目的
①提高酶的活性； ②增强酶的稳定性； ③降低或消除酶的抗原性； ④探讨酶结构与功能之间关系。
18
羟基琥珀酰亚胺活化与偶联反应原理图
生成MPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯
2019/9/5
19
③聚乙二醇马来酸酐衍生物：与马来 酸酐反应生成PM。可通过马来酸酐对酶 分子上的氨基进行修饰，形成酰胺键。 这些蜂窝巢型修饰剂在酶分子表面覆盖 上阴离子基团。
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④聚乙二醇氨类衍生物等：MPEG的羟基 与胺类化合物反应，生成的聚乙二醇胺 类衍生物，可以对酶分子上的羰基进行 修饰。
第五章 酶、细胞、 原生质体固定化
第六章 酶反应器 第七章 酶的应用
2019/9/5
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酶的生物改造（定向进化）略 酶的化学修饰
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酶的化学修饰
基本原理 方法学 应用
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5
第一节 酶分子修饰的基本原理
一、酶分子修饰的概念 通过各种方法使酶分子结构
发生改变，从而改变酶的某些性质 和功能的过程，称为酶分子修饰。
近年来聚乙二醇的活化方法已成为该领 域的研究热点之一。
2019/9/5
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例如，常用的大分子修饰剂单甲氧基聚乙二醇 （MPEG）可以采用多种不同的试剂制备聚乙二醇衍 生物：
①聚乙二醇均三嗪衍生物：MPEG的羟基与均三 嗪(三聚氯氰）可制得MPEG1和MPEG2。后者分子上的 活泼氯离子可以对天冬酰氨酶等酶分子上的氨基进 行修饰。
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二、大分子结合修饰
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使 酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与 功能的方法称为大分子结合修饰。
目前应用最为广泛的酶分子修饰方法。
（一）、大分子结合修饰的方法
1、修饰剂的选择 一般为水溶性大分子。如，聚乙二醇（PEG）、
右旋糖苷、蔗糖聚合物（ficoll）、葡聚糖、环状 糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。
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（二）、大分子修饰的作用
1、通过修饰提高酶活力
例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖苷结合， 可以使酶活力提高2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右 旋糖苷结合，酶活力达到原有活力的5.1倍。
2019/9/5
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第二节 酶分子修饰的方法
酶分子修饰技术不断发展，修wk.baidu.com方法 多种多样。
酶分子修饰主要包括：金属离子置换 修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、 肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修 饰、氨基酸置换修饰、核苷酸置换修饰和 酶分子的物理修饰等。
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一、金属离子置换修饰
把酶分子中的金属离子换成 另一种金属离子，使酶的特性和 功能发生改变的修饰方法称为金 属离子置换修饰。
2019/9/5
11
（一）、金属离子置换修饰的方法
⑴酶的分离纯化：首先获得一定纯度的酶。
⑵除去原有的金属离子：利用螯合剂（EDTA等） 与金属离子形成螯合物，再通过透析、超滤、 分子筛层析等方法，将螯合物除去。
⑶加入置换离子：加入另一种金属离子。常用 的金属离子一般为：Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Zn2＋、 Co2＋、Cu2＋、Fe2＋等二价金属离子。
2019/9/5
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②聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：
MPEG 的 羟 基 与 琥 珀 酰 亚 胺 反 应 ， 生 成 SS-MPEG 、 SSA － MPEG 、 SC-MPEG 等 衍 生 物 。 这些衍生物可以在pH7~10的条件下对酶分子 的氨基进行修饰。
MPEG琥珀酸亚胺碳酸酯
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第四章 酶分子修饰
2019/9/5
1
前言： 酶分子经过修饰以后，可以显著提
高酶的使用范围和应用价值。 酶分子修饰成为酶工程中具有重要
意义和应用前景的领域。 本章主要介绍酶分子修饰的基本原
理、方法与修饰酶的特征。
2019/9/5
2
酶工程
第一章 酶学概述 第二章 酶的生产 第三章 酶的分离纯化 第四章 酶分子修饰
2019/9/5
12
（二）、金属离子置换修饰的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响 2、提高酶的活力
例如：α－淀粉酶，是杂离子型的。 将其他的杂离子换成钙离子，则可以提高酶 活力并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型α －淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型α－ 淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大 增加。
2019/9/5
13
3、增强酶的稳定性
例如：Fe－SOD分子中的铁离子被锰离子置换， 成为Mn－SOD后，其对过氧化氢的稳定性显著增强。 对叠氮钠（NaN3）的敏感性显著降低。
4、改变酶的动力学特性
例如：用钴离子置换酰基化氨基酸水解酶的活 性中心的锌离子，其催化N－氯－乙酰丙氨酸水解的 最适pH值从8.5降低为7.0。同时该酶对N－氯－乙酰 丙氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。