转基因动物
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1980 年由Gorden 等人发明
优点：外源基因的转移率和整合效率较高，转基因效率比较稳 定，注射基因片段大小不受限制，无需载体，制备相对容 易。
缺点：操作技术复杂，设备昂贵，导入外源基因的拷贝数无法 控制，外源基因随机整合到基因组内，常导致宿主DNA 染 色体序列丢失或重排，造成严重的生理缺陷。
（基因剔除，基因打靶或基因定位突变）
利用细胞内染色体DNA可以和导入细胞的外源DNA在相同 序列的区域内发生同源重组的现象，在小鼠胚胎干细胞 （ES细胞)中定点破坏内源的基因，然后利用ES细胞发育的 全能性，获得从ES细胞发育而来的带有预定基因缺陷的杂 合子小鼠，通过遗传育种最后获得目的基因纯合缺陷的小 鼠个体。
优点：操作简单，外源基因的整合率较高。 缺点：外源基因的长度不能超过8kb，整合后的表达率低，有潜在的
致病性和致癌性，所得转基因动物的嵌合性很高，需要广泛杂交， 建立转基因系
体细胞核移植法 先将外源基因导入到体细胞中，选择整合有外源目的基因的体细 胞作核供体，将供体核移植到去核卵母细胞进行动物克隆。
显微注射到基因打靶
• 1980年Gordon将克隆基因原核注射导入小鼠体组织 • 1982年Palmiter等将小鼠MT-I基因启动子与大鼠生长激素基因重组注入小
鼠受精卵获得转大鼠生长激素的小鼠
转基因兔、绵羊、猪和鱼等
• ES细胞注射到宿主囊胚细胞并植入代孕小鼠形成的嵌合体能分化为包括 生殖细胞在内的多种组织
• 胚胎干细胞的应用 从囊胚分离到胚胎干细胞（ES） San Francisco的Gail Martin 英国剑桥的Martin Evans Matt Kaufman
• 输卵管和子宫移植最优化条件的摸索 英国Anne McLaren
• 畸胎瘤为模型研究早期发育
分子遗传学研究
• 1974年 Rudolf Jaenisch和Beatrice Mintz 将猴空泡病毒 SV40的DNA注射到 小鼠囊胚的囊胚腔，小鼠体组织可检测到病毒DNA序列，表明病毒DNA 整合到胚胎细胞基因组
• 转基因小鼠 • 基因敲除转基因小鼠 • 时空调控转基因小鼠
转基因动物常用的制作方法
• 受精卵雄原核的纤维注射 • 精子载体法 • 胚胎干细胞囊胚注射或聚合 • 逆转录病毒转染 • 体细胞核移植法
受精卵雄原核的纤维注射（胞质内显微注射法）
原理：通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核 内，使外源基因整合到DNA 中，发育成转基因动物。已相 继获得转基因猪、绵羊、兔、牛、山羊等。
• 只有当外源基因整合进去的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时,才能将外源基因
遗传给子代;否则,外源基因不能传给子代。
• 胚胎干细胞法,逆转录病毒载体法产生的第一代转基因动物均为嵌合体动物
显微注射法得到的第一代转基因动物也约有20 %为此类动物
转基因动物的鉴定
(1) 分子杂交法。主要包括DNA 印迹法和斑点杂交法。 (2) PCR 法
1984 年Bradley 等用囊胚注射法获得首例小鼠ES 细胞种系嵌合体。 1992 年Magin等将小鼠干细胞注入到囊胚中获得生殖腺嵌合的小鼠。
优点：在克隆的ES 细胞被转移到动物胚胎之前，可先把外源重组 DNA 整合到细胞的染色体组中，然后将这些胚胎干细胞进行筛选，找到 理想的ES细胞，使转基因动物的生产效率明显提高。
2 组织特异性表达
标记基因或报告基因 • lacZ β-半乳糖苷酶 • CAT 氯霉素乙酰转移酶 • Luciferase 荧光素酶 • hGH 生长激素基因 原核载体序列的影响
显著影响整合转基因的表达常为抑制
雄原核显微注射
1注射前的准备 2注射 3注射卵的移植
雄原核显微注射流程图
举例 基因敲除转基因小鼠
含人凝血因子IX 的转基因山羊（1998） 含人血清白蛋白基因的转基因奶牛（1999）
建立转基因动物的主要策略：
一 转基因在动物体内过度表达
• 转基因可用基因本身的启动子,也可拼接组织特异性表达 的外源启动子
• 可转入单基因,也可转入多个基因 二 让基因在体内灭活,丧失其功能,即基因敲除技术
转基因小鼠
1997 年英国PPL 公司与罗斯林研究所用该法得到克隆羊Dolly 1998年 Cibelli获得了转基因牛 2001年Bondioli获得了转基因猪
优点：得到转基因动物的总效率高于原核显微注射法。产生转基因 后代遗传背景及遗传稳定性一致，不需选配就可建立转基因群体
缺点：胎儿的死亡率高
嵌合体动物(chimera , mosaic animals) ：建立转基因动物时,外源基 因可能只整合入动物的部分组织细胞的基因组,也可能整合进动物 所有组织细胞的基因组中。把只有部分组织的基因组中整合有外 源基因的动物,称为嵌合体动物。
基因剔除的技术路线
构建基因剔除载体质粒
电转移方法引入ES细胞
用Neo基因和TK基因筛选ES细胞克隆 用PCR和Southern杂交筛选重组阳性ES细胞
扩增ES细胞克隆
将ES细胞通过显微注射注入囊胚腔内ES细胞和8细胞胚胎聚合Baidu Nhomakorabea
导入假孕保姆鼠子宫、得到嵌合鼠
和B6或129小鼠回交得到F1代小鼠 通过PCR或Southern杂交确认F1代小鼠中带有目的基因突变杂合子
1985年和1986年分别获得了含人生长激素(MT-hGH）基因的转 基因泥鳅和小鼠
1987年获得含有大肠杆菌半乳糖激酶 galk 和鸟嘌呤-次黄嘌呤 磷酸核糖转移酶 gpt基因的转基因小鼠
以后又相继获得了含乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基 因猪
含促红细胞生成素 (EPO)基因和人乙型肝炎表面抗原基因（Hbs Ag）的二种乳腺特异性表达的转基因山羊
时空调控转基因小鼠
• 四环素调控系统 • 条件基因剔除
四环素调控系统 • 原理 • Tet-Off调控系统 • Tet-On调控系统
转基因技术存在的问题
基因整合和表达效率低, 生产一头有用的转基因动物，需用大量供 体和受体动物，涉及很高的研究费用，转基因动物产业化受到很 大限制。
Homologous recombination
NeoR
HSVtk
Linearized replacement plasmid
Random integration
NeoR
NeoR+/ HSVtk-
NeoR+/ HSVtk+
囊胚注射获得嵌合体小鼠 • 嵌合体胚胎的获得（同源重组的ES细胞注射到妊娠3.5天小鼠囊胚腔或8
杂合子小鼠相互交配，有1/4几率得到突变型纯合子 用Northern杂交和Western杂交确认基因表达改变 观察和分析纯合子或杂合子表型
基因打靶的靶细胞－ES细胞
•ES细胞从胚胎分离的多潜能细胞 •培养皿中加入白血病抑止因子（LIF）可使细胞 保持分化的全能性即发育成一个完整个体各种组 织细胞的能力 •体外操作方便 已建多个稳定的ES细胞株
• Jaenisch感染附植前胚胎，将莫洛尼鼠类白血病病毒 (Moloney murine leuke mia virus，M-MLV RT）稳定地导入小鼠生殖细胞
• 1980年将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV－ tk）基因纤维注射到成纤 维细胞的核中，受体细胞可稳定转染 提示将DNA显微注射到单细胞的小鼠胚胎中，可使这段克隆基因导入到发 育中的小鼠内
得成功。 2002 年Lavitrano 等成功建立了抗衰老hDAF 的转基因猪并表达。
优点：方法相对简单、易行，不需昂贵的显微操作设施及复杂的操作技巧； 对大型农场动物而言，经活体方法获取未受精卵，通过精子体外授精， 不需宰杀母畜。
缺点：实验结果不稳定，可重复性差。
胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell ,ES 细胞）是动物早期胚 胎（桑葚胚或 囊胚）的内细胞团（ICM）。该方法是将基因导入胚胎干细胞，然后将转 基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体， 通过杂交繁育得到含纯合目的基因的个体，即生产出转基因动物。
细胞期胚胎透明带下或与8细胞期胚胎聚合） • 嵌合体胚胎移植到假孕受体小鼠子宫内 要想传给后代，ES细胞须整合到生殖细胞 杂合子的获得 • 和B6或129小鼠回交得到F1代小鼠 • 通过PCR或Southern杂交确认F1代小鼠中带有目的基因突变 （杂合子） 纯合子的获得 • 杂合子小鼠相互交配，有1/4几率得到突变型纯合子 • 用Northern杂交和Western杂交确认基因表达改变 • 或观察和分析纯合子或杂合子表型
举例介绍
转基因小鼠 －－显微注射法制备转基因小鼠 两个主要技术环节 • 设计转基因构件 • 受精卵雄原核的显微注射技术
设计转基因构件（目的基因、启动子、加强子、标记基因、报告基因）
转基因调控序列基因（加强子、启动子） 启动子的选择
1 若要外源基因全身一致表达转基因品系可选管家基因启动子 b-肌动蛋白启动子b-actin 小鼠金属硫蛋白 组蛋白H4启动子
转基因动物的研究背景
胚胎学研究
• 体外小鼠胚胎培养 8 细胞桑椹胚至囊胚 John Hammond Jr
1细胞受精卵至囊胚 1956澳大利亚Wesley Whitten
• 蛋白酶温和消化透明带
• 受精小鼠卵间的核移植 Phildephia Wistar研究所 Davor Solter
• 嵌合体技术 英国剑桥Richard Gardner分离出的细胞注射入宿主囊胚
Robertson等发现整合到细胞中的逆转录病毒能通过生殖系转移 Gossler等证明neor基因能被转移 Hooper等和Kuehn等选用缺乏HPRT基因的突变ES细胞得缺乏 HPRT基因 公鼠
证明在培养皿中对ES细胞进行可控制遗传操作获得的突变导入生殖细胞是 可行的
我国的转基因动物研究
1984年开始进行转基因动物研究，同年获得了含人β- 珠蛋白 基因的转基因小鼠
• 加新霉素或其类似物G418和环氧丙苷GCV进行筛选
1外源打靶基因载体未能整合在内源基因组DNA上，
n
eor-/tk- 细胞死亡
2 neor+/tk+ 鸟苷类似物GCV在细胞中胸苷激酶作用下转变成
GCV三磷酸，抑制DNA聚合酶活性，与dTTP竞争参入合成 DNA 细胞死亡
3 neor+/ tk- 与内源基因组DNA 发生同源重组，外源基因代替 基因组基因,HSV-tk在同源序列之外未被整合 细胞存活
缺点：是ES建株很困难，需要预先选择和克隆基因转移型细胞，对小鼠来说 繁殖嵌合体比较容易，但对家畜有一定难度。
逆转录病毒感染法 利用逆转录病毒DNA 的LTR 区域具有转录启动子活性，将外源基因 连接到LTR 下部进行重组后，携带外源基因的逆转录病毒 DNA 可 以整合到宿主染色体上。
1987 年Salter 等用鸡白血病病毒作为载体生产转基因鸡 1989 年Bosselman 等用网状内皮组织增生病毒作载体将GH 基因导入牛胚胎 1995 年Biery 等用劳式肉瘤病毒（RSV）为载体导入牛的胚胎，生产出转基因牛
精子载体法 DNA 易被精子所摄取，利用精子作为载体导入外源基因，然后进行体外受 精。是目前研究转基因动物的一个热点。
1989 年Lavitrano 等首次报道把PSV2 CAT 质粒与小鼠的附睾精子共育后进行体外受精，移植 后获得了阳性鼠。
同年，Ganodolfi 等在猪上均采用精子载体法转基因成功。 1993 年，Squires 等把外源DNA 用脂质体包装后，与鸡精子共孵育，然后进行人工授精，获
构建打靶载体和ES细胞的筛选 构建打靶载体
• 此载体含有一段与想要灭火的基因有高度同源性的外源基 因即靶基因
• 在打靶基因的同源序列中插入新霉素抗性基因neor • 在其3‘端插入不含启动子的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因
（HSV-tk）
ES细胞的筛选
• 外源基因重组载体引入体外培养的ES细胞
（电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒介导等）
转基因动物
转基因动物
转基因动物(transgenic animal s) 是指基因组中整合有外源基因的一类 动物;外源基因可以遗传给子代。
整入动物基因组的外源基因被称为转基因(transgene）
研究意义 • 促进从胚胎发生、基因功能到动物行为等领域的研究 • 建立遗传疾病模型，解决与发育生物学有关的问题
优点：外源基因的转移率和整合效率较高，转基因效率比较稳 定，注射基因片段大小不受限制，无需载体，制备相对容 易。
缺点：操作技术复杂，设备昂贵，导入外源基因的拷贝数无法 控制，外源基因随机整合到基因组内，常导致宿主DNA 染 色体序列丢失或重排，造成严重的生理缺陷。
（基因剔除，基因打靶或基因定位突变）
利用细胞内染色体DNA可以和导入细胞的外源DNA在相同 序列的区域内发生同源重组的现象，在小鼠胚胎干细胞 （ES细胞)中定点破坏内源的基因，然后利用ES细胞发育的 全能性，获得从ES细胞发育而来的带有预定基因缺陷的杂 合子小鼠，通过遗传育种最后获得目的基因纯合缺陷的小 鼠个体。
优点：操作简单，外源基因的整合率较高。 缺点：外源基因的长度不能超过8kb，整合后的表达率低，有潜在的
致病性和致癌性，所得转基因动物的嵌合性很高，需要广泛杂交， 建立转基因系
体细胞核移植法 先将外源基因导入到体细胞中，选择整合有外源目的基因的体细 胞作核供体，将供体核移植到去核卵母细胞进行动物克隆。
显微注射到基因打靶
• 1980年Gordon将克隆基因原核注射导入小鼠体组织 • 1982年Palmiter等将小鼠MT-I基因启动子与大鼠生长激素基因重组注入小
鼠受精卵获得转大鼠生长激素的小鼠
转基因兔、绵羊、猪和鱼等
• ES细胞注射到宿主囊胚细胞并植入代孕小鼠形成的嵌合体能分化为包括 生殖细胞在内的多种组织
• 胚胎干细胞的应用 从囊胚分离到胚胎干细胞（ES） San Francisco的Gail Martin 英国剑桥的Martin Evans Matt Kaufman
• 输卵管和子宫移植最优化条件的摸索 英国Anne McLaren
• 畸胎瘤为模型研究早期发育
分子遗传学研究
• 1974年 Rudolf Jaenisch和Beatrice Mintz 将猴空泡病毒 SV40的DNA注射到 小鼠囊胚的囊胚腔，小鼠体组织可检测到病毒DNA序列，表明病毒DNA 整合到胚胎细胞基因组
• 转基因小鼠 • 基因敲除转基因小鼠 • 时空调控转基因小鼠
转基因动物常用的制作方法
• 受精卵雄原核的纤维注射 • 精子载体法 • 胚胎干细胞囊胚注射或聚合 • 逆转录病毒转染 • 体细胞核移植法
受精卵雄原核的纤维注射（胞质内显微注射法）
原理：通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核 内，使外源基因整合到DNA 中，发育成转基因动物。已相 继获得转基因猪、绵羊、兔、牛、山羊等。
• 只有当外源基因整合进去的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时,才能将外源基因
遗传给子代;否则,外源基因不能传给子代。
• 胚胎干细胞法,逆转录病毒载体法产生的第一代转基因动物均为嵌合体动物
显微注射法得到的第一代转基因动物也约有20 %为此类动物
转基因动物的鉴定
(1) 分子杂交法。主要包括DNA 印迹法和斑点杂交法。 (2) PCR 法
1984 年Bradley 等用囊胚注射法获得首例小鼠ES 细胞种系嵌合体。 1992 年Magin等将小鼠干细胞注入到囊胚中获得生殖腺嵌合的小鼠。
优点：在克隆的ES 细胞被转移到动物胚胎之前，可先把外源重组 DNA 整合到细胞的染色体组中，然后将这些胚胎干细胞进行筛选，找到 理想的ES细胞，使转基因动物的生产效率明显提高。
2 组织特异性表达
标记基因或报告基因 • lacZ β-半乳糖苷酶 • CAT 氯霉素乙酰转移酶 • Luciferase 荧光素酶 • hGH 生长激素基因 原核载体序列的影响
显著影响整合转基因的表达常为抑制
雄原核显微注射
1注射前的准备 2注射 3注射卵的移植
雄原核显微注射流程图
举例 基因敲除转基因小鼠
含人凝血因子IX 的转基因山羊（1998） 含人血清白蛋白基因的转基因奶牛（1999）
建立转基因动物的主要策略：
一 转基因在动物体内过度表达
• 转基因可用基因本身的启动子,也可拼接组织特异性表达 的外源启动子
• 可转入单基因,也可转入多个基因 二 让基因在体内灭活,丧失其功能,即基因敲除技术
转基因小鼠
1997 年英国PPL 公司与罗斯林研究所用该法得到克隆羊Dolly 1998年 Cibelli获得了转基因牛 2001年Bondioli获得了转基因猪
优点：得到转基因动物的总效率高于原核显微注射法。产生转基因 后代遗传背景及遗传稳定性一致，不需选配就可建立转基因群体
缺点：胎儿的死亡率高
嵌合体动物(chimera , mosaic animals) ：建立转基因动物时,外源基 因可能只整合入动物的部分组织细胞的基因组,也可能整合进动物 所有组织细胞的基因组中。把只有部分组织的基因组中整合有外 源基因的动物,称为嵌合体动物。
基因剔除的技术路线
构建基因剔除载体质粒
电转移方法引入ES细胞
用Neo基因和TK基因筛选ES细胞克隆 用PCR和Southern杂交筛选重组阳性ES细胞
扩增ES细胞克隆
将ES细胞通过显微注射注入囊胚腔内ES细胞和8细胞胚胎聚合Baidu Nhomakorabea
导入假孕保姆鼠子宫、得到嵌合鼠
和B6或129小鼠回交得到F1代小鼠 通过PCR或Southern杂交确认F1代小鼠中带有目的基因突变杂合子
1985年和1986年分别获得了含人生长激素(MT-hGH）基因的转 基因泥鳅和小鼠
1987年获得含有大肠杆菌半乳糖激酶 galk 和鸟嘌呤-次黄嘌呤 磷酸核糖转移酶 gpt基因的转基因小鼠
以后又相继获得了含乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基 因猪
含促红细胞生成素 (EPO)基因和人乙型肝炎表面抗原基因（Hbs Ag）的二种乳腺特异性表达的转基因山羊
时空调控转基因小鼠
• 四环素调控系统 • 条件基因剔除
四环素调控系统 • 原理 • Tet-Off调控系统 • Tet-On调控系统
转基因技术存在的问题
基因整合和表达效率低, 生产一头有用的转基因动物，需用大量供 体和受体动物，涉及很高的研究费用，转基因动物产业化受到很 大限制。
Homologous recombination
NeoR
HSVtk
Linearized replacement plasmid
Random integration
NeoR
NeoR+/ HSVtk-
NeoR+/ HSVtk+
囊胚注射获得嵌合体小鼠 • 嵌合体胚胎的获得（同源重组的ES细胞注射到妊娠3.5天小鼠囊胚腔或8
杂合子小鼠相互交配，有1/4几率得到突变型纯合子 用Northern杂交和Western杂交确认基因表达改变 观察和分析纯合子或杂合子表型
基因打靶的靶细胞－ES细胞
•ES细胞从胚胎分离的多潜能细胞 •培养皿中加入白血病抑止因子（LIF）可使细胞 保持分化的全能性即发育成一个完整个体各种组 织细胞的能力 •体外操作方便 已建多个稳定的ES细胞株
• Jaenisch感染附植前胚胎，将莫洛尼鼠类白血病病毒 (Moloney murine leuke mia virus，M-MLV RT）稳定地导入小鼠生殖细胞
• 1980年将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV－ tk）基因纤维注射到成纤 维细胞的核中，受体细胞可稳定转染 提示将DNA显微注射到单细胞的小鼠胚胎中，可使这段克隆基因导入到发 育中的小鼠内
得成功。 2002 年Lavitrano 等成功建立了抗衰老hDAF 的转基因猪并表达。
优点：方法相对简单、易行，不需昂贵的显微操作设施及复杂的操作技巧； 对大型农场动物而言，经活体方法获取未受精卵，通过精子体外授精， 不需宰杀母畜。
缺点：实验结果不稳定，可重复性差。
胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell ,ES 细胞）是动物早期胚 胎（桑葚胚或 囊胚）的内细胞团（ICM）。该方法是将基因导入胚胎干细胞，然后将转 基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体， 通过杂交繁育得到含纯合目的基因的个体，即生产出转基因动物。
细胞期胚胎透明带下或与8细胞期胚胎聚合） • 嵌合体胚胎移植到假孕受体小鼠子宫内 要想传给后代，ES细胞须整合到生殖细胞 杂合子的获得 • 和B6或129小鼠回交得到F1代小鼠 • 通过PCR或Southern杂交确认F1代小鼠中带有目的基因突变 （杂合子） 纯合子的获得 • 杂合子小鼠相互交配，有1/4几率得到突变型纯合子 • 用Northern杂交和Western杂交确认基因表达改变 • 或观察和分析纯合子或杂合子表型
举例介绍
转基因小鼠 －－显微注射法制备转基因小鼠 两个主要技术环节 • 设计转基因构件 • 受精卵雄原核的显微注射技术
设计转基因构件（目的基因、启动子、加强子、标记基因、报告基因）
转基因调控序列基因（加强子、启动子） 启动子的选择
1 若要外源基因全身一致表达转基因品系可选管家基因启动子 b-肌动蛋白启动子b-actin 小鼠金属硫蛋白 组蛋白H4启动子
转基因动物的研究背景
胚胎学研究
• 体外小鼠胚胎培养 8 细胞桑椹胚至囊胚 John Hammond Jr
1细胞受精卵至囊胚 1956澳大利亚Wesley Whitten
• 蛋白酶温和消化透明带
• 受精小鼠卵间的核移植 Phildephia Wistar研究所 Davor Solter
• 嵌合体技术 英国剑桥Richard Gardner分离出的细胞注射入宿主囊胚
Robertson等发现整合到细胞中的逆转录病毒能通过生殖系转移 Gossler等证明neor基因能被转移 Hooper等和Kuehn等选用缺乏HPRT基因的突变ES细胞得缺乏 HPRT基因 公鼠
证明在培养皿中对ES细胞进行可控制遗传操作获得的突变导入生殖细胞是 可行的
我国的转基因动物研究
1984年开始进行转基因动物研究，同年获得了含人β- 珠蛋白 基因的转基因小鼠
• 加新霉素或其类似物G418和环氧丙苷GCV进行筛选
1外源打靶基因载体未能整合在内源基因组DNA上，
n
eor-/tk- 细胞死亡
2 neor+/tk+ 鸟苷类似物GCV在细胞中胸苷激酶作用下转变成
GCV三磷酸，抑制DNA聚合酶活性，与dTTP竞争参入合成 DNA 细胞死亡
3 neor+/ tk- 与内源基因组DNA 发生同源重组，外源基因代替 基因组基因,HSV-tk在同源序列之外未被整合 细胞存活
缺点：是ES建株很困难，需要预先选择和克隆基因转移型细胞，对小鼠来说 繁殖嵌合体比较容易，但对家畜有一定难度。
逆转录病毒感染法 利用逆转录病毒DNA 的LTR 区域具有转录启动子活性，将外源基因 连接到LTR 下部进行重组后，携带外源基因的逆转录病毒 DNA 可 以整合到宿主染色体上。
1987 年Salter 等用鸡白血病病毒作为载体生产转基因鸡 1989 年Bosselman 等用网状内皮组织增生病毒作载体将GH 基因导入牛胚胎 1995 年Biery 等用劳式肉瘤病毒（RSV）为载体导入牛的胚胎，生产出转基因牛
精子载体法 DNA 易被精子所摄取，利用精子作为载体导入外源基因，然后进行体外受 精。是目前研究转基因动物的一个热点。
1989 年Lavitrano 等首次报道把PSV2 CAT 质粒与小鼠的附睾精子共育后进行体外受精，移植 后获得了阳性鼠。
同年，Ganodolfi 等在猪上均采用精子载体法转基因成功。 1993 年，Squires 等把外源DNA 用脂质体包装后，与鸡精子共孵育，然后进行人工授精，获
构建打靶载体和ES细胞的筛选 构建打靶载体
• 此载体含有一段与想要灭火的基因有高度同源性的外源基 因即靶基因
• 在打靶基因的同源序列中插入新霉素抗性基因neor • 在其3‘端插入不含启动子的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因
（HSV-tk）
ES细胞的筛选
• 外源基因重组载体引入体外培养的ES细胞
（电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒介导等）
转基因动物
转基因动物
转基因动物(transgenic animal s) 是指基因组中整合有外源基因的一类 动物;外源基因可以遗传给子代。
整入动物基因组的外源基因被称为转基因(transgene）
研究意义 • 促进从胚胎发生、基因功能到动物行为等领域的研究 • 建立遗传疾病模型，解决与发育生物学有关的问题