实验一血液标本采集和血涂片制备

耳垂： 不宜使用
手指
成人：左手无名指或中指指端内侧(WHO) 婴幼儿：大拇趾
或 足跟 内外侧缘
严重烧伤患者：皮肤完整处
血液标本的采集
二、器材与试剂：无菌一次性采血针、一次性微量吸管、
消毒干棉球、无菌干棉球、小试管、75%乙醇、生理盐水等。
血液标本的采集
三、操作步骤
1、准备 2、按摩 3、消毒
按摩：轻轻按摩采血部位，使其自然充血。 消毒：用75%乙醇消毒棉球消毒。 针刺：待酒精挥发干后，用左手拇指和食指
【染色步骤】
❖ A、待涂片在空气中完全干燥 后，滴加数滴Wright’s染液 盖满血膜为止，染色1 min。
❖ B、滴加等量或稍多的缓冲液， 混匀，染色5-10分钟。
❖ C、用流水冲去染液，吸水纸 吸干，镜检。
【质量控制】
血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落. 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般
血液标本的采集
四、注意事项
1.采血部位不能有冻疮、紫绀、水肿和炎症等。 2.消毒后，待酒精干后采血。 3.取血时切忌用力挤压。 4.进行多项检查时，采集标本的顺序依次为:
PLT计数、RBC计数、Hb测定、WBC计数 及分类、血型鉴定等。
血液标本的采集
五、方法学评价
1. 操作方便； 2. 每人的皮肤厚度不同，无法控制
液。
价廉、快速、操作简便， 标本代表性大，无
优 标本可直接测定 点
组织液影响，适用 于临床研究，可重 复实验和追加其他
实验。
血液标本的采集
优点：防溶血 防标本污染 防交叉感染 可多管采集
缺点：成本较高
血液标本的采集
一次性使用静脉采血针
瓶塞穿刺针套 （防止血液泄漏）
血液标本的抗凝
抗凝：用物理或化学的方法，去除或抑 制某些凝血因子，阻止血液凝固。
血液标本的采集
三、采血步骤 四、注意事项
1.防止标本溶血。 2.压脉带压迫时间不能过长。 3.切忌将注射器往静脉内推。
毛细血管采血与静脉采血优缺点比较
毛细血管采血
静脉采血
限制了重复实验和追加实 不同抗凝剂的使用， 缺 验，标本量少，局部炎症 改变血液性质，影 点 可得假结果，可混入组织 响有形成分的形态
巴氏染色法
❖ 是脱落细胞染色法中较好的染色方法。
步骤
1.采血前准备 2.选择静脉 3.消毒 4.扎压脉带 5.穿刺 6.抽血 7.放血 8.采血完毕
(a)刺入静脉 (c)针头抽出
(b)静脉抽血 (d)注入试管
中性杆状核粒细胞
嗜酸性粒细胞
嗜碱性Biblioteka Baidu细胞
姬姆萨染色法
[原理]
吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结 果与 瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色 较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色 较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释 吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先 用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。
图1-3 血涂片制备示意图（上：侧面观，下：正面观）
血涂片制备
推片 血液
载玻片
将推片匀速向前，勿停顿。涂片的厚 薄取决于速度和角度：快、大(厚)。 慢、小（薄）
一张满意的血涂片应厚薄均匀
头
体
尾鲜明
涂片干燥后用铅笔在血涂片的头 部写上姓名和编号
B123
李 四
血涂片的观察
低倍镜观察
1.染色情况(满意、偏酸、偏碱） 2. 细胞分布情况 油镜下分类计数：体尾交界处。
均比静脉血低10%左右 B.手指采血时流出的第一滴血即可用于检查 C.婴儿宜用耳垂或手指采血
3）不与Ca2+作用,但能阻止血液凝固的抗凝剂是 A.草酸盐 B.EDTA-K2 C.肝素 D.枸橼酸钠 4）下列几种抗凝剂，哪种最适宜用于血细胞计数 A. 乙二胺四乙酸二钾(EDTA－K2) B.枸橼酸钠 C.草酸钠 D.草酸钾 5）肝素作为抗凝剂,下列叙述错误的是 A.具有较强的抗凝能力 B.不影响血细胞体积 C.过量使用可引起白细胞聚集 D.适用于做白细胞分类计数
油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。
李 四
123
体尾交界处
理理想想区区域域
细胞重叠
细胞太稀
细胞染色法的类型
普通染色法： 经物理和/或化学作用的吸附、结合 荧光染色法：荧光染料，荧光显微镜 细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等 细胞化学染色法：用化学反应显示细胞内某种成分 细胞免疫化学染色法（应用单克隆抗体技术、酶标记
细胞核蛋白、淋巴细胞及嗜碱性粒细胞染成蓝色。
酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。如伊红。能
结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性
颗粒成分等染成红色。
[试剂]
Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml 甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，
并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与 染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色 效果。 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无 水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到 1000ml。 配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。
【试剂】
瑞特染料 1.0g 吉姆萨染料 0.3g 甲醇（AR) 加至500ml
先将瑞特染料和吉姆萨染料充分研磨混匀，甲醇溶 解倒入容器中，未溶解完的继续加入甲醇研磨，重复 多次，最后把染液加至500ml。
[染色方法]
血片加滴加染液5滴，并立即将染液盖满血膜， 2min后加入pH6.4-6.8磷酸盐缓冲液（同瑞氏染液） 10滴，10min后用流水冲洗干净，待干后镜检。
任务二 血涂片制备和细胞染色
血涂片的显微检查是血液细胞学检查的 基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对 于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年 来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察 也可作为判断仪器结果的简易方法。 血涂片的用途：血细胞形态学检验、网织 红、 寄生虫检验。
一、手工推片法
将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片 的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。
【质量控制】
❖ 同瑞氏染色法
【方法学评价】
瑞氏染液和吉姆萨染液对细胞进行染色时有各自的 显色特征，前者对细胞质和颗粒着色较好，后者对细 胞核结构显示清晰。因此将二者结合，能取长补短、 集中优势，用该混合染液对血细胞进行染色，其细胞 核、细胞质和细胞内颗粒均着色鲜艳，对比鲜明。瑞 氏-吉姆萨混合染色法是临床上广泛使用的方法。
血液标本的抗凝
四.乙二胺四乙酸（EDTA）盐 抗凝原理：与钙离子结合形成螯合物 适用项目：EDTA-K2用于血细胞计数(ICSH)
血细胞比容测定 不适于凝血象检查及血小板功能试验。
血液标本的抗凝
五.肝素 抗凝原理：加强抗凝血酶Ⅲ灭活丝氨酸蛋
白酶，从而阻止凝血酶形成、抑制血小板聚集。
适用项目：红细胞渗透脆性试验、血细胞比容测定
捏紧采血部位，右手持采血针，迅速刺入2～3mm。
4、针刺 5、拭血
拭血：待血自然流出后，无菌干棉球擦去第一滴 血。
6、吸血 7、稀释
吸血：按需要依次采血采血完毕，用干棉球压住伤口片刻。 稀释：无菌干棉球擦净吸管外余液，将吸管伸入装有生理
盐水的试管底部，慢慢排除吸管内的血液，上清液清洗管内 余血2～3次。将试管内的液体混匀。
技术）
二、血液涂片染色
对细胞质 着色较好
对细胞核 着色较好
固定着色合并进行，简
（一）瑞氏染色法
便，染色时间短， WBC特异性颗粒着色
较好，细胞核着色较差。
瑞氏染料的组成：由酸性染料伊红和碱性染料亚甲
蓝组成的复合染料溶于甲醇制备而成。
碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，细胞核的染
料。如亚甲蓝、天青。能结合酸性物质并染色，如
物理方法抗凝：脱纤维蛋白 将血液注入到有玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠 绕凝固在玻璃球上，从而防止血液凝固成块。适用于 免疫学检验、红斑性狼疮细胞和细菌培养血培养基的 制备。
抗凝剂(anticoagulant)：能够阻止血液凝固 的化学试剂或物质。
常用抗凝剂：枸橼酸钠、草酸钠、二草酸盐、 乙二胺四乙酸二钠（EDTA)、肝素
[试剂]
吉姆萨染料 甘油 甲醇（AR）
1.0g 66.0ml 66.0ml
[染色方法] 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 将血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水冲洗,待干后镜检
瑞氏-吉姆萨染色
【原理】 将瑞特染料和吉姆萨染料按一定比例混合后对细胞进
行染色，其染色原理同瑞特和吉姆萨染色法，但染色效 果更佳，因为其综合了瑞氏和吉姆萨染色法的优点。
染液淡、染色时间长些效果好。 染液不能过少，以防蒸发沉淀。 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料 沉着。冲洗时间也不能长。 染色过淡，可复染。 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色.
嗜嗜碱碱性性粒粒细细胞胞
嗜碱性粒细胞
中性粒细胞
嗜多色性红细胞
嗜酸性粒细胞
图1-4 瑞氏染色原理示意图
采血刺入的深度； 3. 常需挤压诱导，导致组织液混入，
影响结果准确性； 4. 标本不能重复应用； 5. 取血量少(<0.1ml)。
血液标本的采集
用于需血量较多或全自动血液分析仪测定。 一、采血部位
常用肘部静脉,也可手背或外踝静脉等。
二、器材与试剂
注射器、压脉带、垫枕、75%酒精、 碘酒、无菌棉签(球)等。
实验一 血液标本采集和血涂片制备
重点：1.血标本采集方法和血涂片制备技术 2.抗凝剂的应用
难点：血细胞染色原理
一. 掌握血液标本的采集方法及注意事项。 二. 熟悉常用的血液抗凝剂种类及其应用。 三、掌握血涂片的制备与细胞染色原理。
任务一 血液标本的采集及抗凝
血液标本的采集
适用于需血量少(<0.1ml)的检查。 一、采血部位
血液流变学检查、多种生化分析 不适于白细胞计数及分类计数
血液标本的抗凝
柠檬酸钠抗凝（抗凝比例1：9） 用于凝血象检查 加入促凝剂，用于普通生化检查
EDTA-K2抗凝，用于血常规检查
肝素钠抗凝，用于血流变学检查等 柠檬酸钠抗凝（抗凝比例1：4） 用于红细胞沉降率的测定
1.毛细血管采血时应注意些什么？ 2.常用的血液抗凝剂有哪些？ 3.选择题： 1）新生儿做血细胞计数，多用下列哪个部位采血 A.手背 B.耳垂 C.足跟 D.左手无名指 2）关于毛细血管采血法，下列正确的是 A.耳垂血的红细胞、白细胞、血细胞比容结果
血液标本的抗凝
一.枸橼酸钠（柠檬酸钠）
抗凝原理：与血中钙离子结合形成螯合物 适用项目：凝血象检查、红细胞沉降率、 血液保养液
血液标本的抗凝
二.草酸钠 三.双草酸盐抗凝剂 抗凝原理：与钙离子形成草酸钙沉淀。
草酸钾(钠)使RBC皱缩，草酸铵使RBC胀大。
适用项目：血细胞比容、红细胞(计数） 不适于血小板计数和白细胞分类计数