微生物实验报告(棉花黄萎病菌)

重庆邮电大学生物信息学院

微生物实验报告

实验题目棉花黄萎病菌的分离与纯化

实验人员罗秋兰范欢卢正兴

汤丽刘培

填写时间:2010年12 月22日

重庆邮电大学生物信息学院制

一、选题背景

棉花是我国重要的经济作物，特别是在新疆，山东等地区种植面积非常大。一些农民更是以种植棉花来养家糊口。用棉花加工而成的产品数不胜数，我们的日常生活离不开棉花。

而在当前，棉花黄萎病是影响我国棉花产量与品质的主要病害之一，是由大丽轮枝菌(Vertillium dahliae Kleb．)引起的一种危害性极大的维管束系统病害,该病原菌分布范围广,可浸染双子叶植物及单子叶植物,寄主多达600多种,一旦爆发造成严重经济损失. 在全球因黄萎病所造成的经济损失平均每年达10亿多美元。自20世纪70年代以来,中国棉花黄萎病有发展和蔓延的趋势近年来,我国棉花黄萎病菌致病力分化明显,病害在田间表现出多种症状类型. 国内外在棉花黄萎病防治及抗病育种方面虽然取得了一些进展，但进展缓慢。这是因为棉花黄萎病是一种土传病害，利用物理化学手段进行黄萎病的防治效果甚微。

二、实验目的

通过对棉花黄萎病菌的培养、分离、纯化，掌握此病菌的理化性质；通过此次实际操作，掌握微生物的分离纯化的具体方法以及培养基的制作方法。

三、实验步骤

（一）土壤取样

（二）制备培养基

我们采用的是选择培养基，成分为:蔗糖5克，磷酸钾 1克,硝酸钠 2克，氯化钾 0.5克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.01克,蒸馏水1000毫升,克菌丹0.5ppm,PCNB 350ppm,井岗霉素2.5ppm,氯霉素、链霉素、青霉素各250ppm，琼脂少量。在这种培养基上细菌很少生长,V.dahliae 菌落呈黑色,稍凸起,杂菌主要为白色的镰刀菌,但对 V.dahliae 计数影响不大。

（三）高温消毒

将所需要的所有实验用具和所制得的培养基，放入灭菌锅内，进行高温蒸汽灭菌

（四）稀释样品液

将所得到的土壤样品先第一次加入10ML蒸馏水中进行稀释，静置，沉淀，取1ML上清液到另一干净的试管中，加蒸馏水定容至10ML,重复上述步骤4次，得到五种不同浓度的稀释液。具体步骤如图所示：

（五）平板涂布法培养

1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取大肠杆菌（或葡萄球菌）培养物少许。

2、左手斜持平板，皿盖留在桌上，于火焰近处将菌涂于平板上端，来回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的 1/10），划线时接种环与平板表面成30~40º角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。

3、烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。

4、划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置23℃孵育培养数天后观察结果。

（六）分离、纯培养

在第一次的培养完成之后，将在培养基上长出来的各个单菌落，分别又重新接种到PDA

培养基上进行第二次的纯培养，

等到长出大量的纯菌落时，再根据菌落的形态，颜色等判断是否得到了我们所需要的细菌

（七）关于一些细菌的生化试验

我们对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌做了一系

列生化实验。有对油脂的降解能力实验、对淀粉的降解实验、1、对油脂的降解能力实验

草杆菌无。

2、对淀粉的降解实验

原理：如果细菌能降解淀粉，则加碘培养基不变蓝。

结果：这三种菌落均能产生淀粉酶

3、对糖的酵解实验

原理：如果细菌对糖酵解，则会产生酸，使溶液PH值下降，锈钾离子由紫色变成黄色。

对金黄色葡萄球菌进行革兰氏染色，判断其为阴性菌或者菌。

实验主要步骤：

制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检

（1）制片：涂片（在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌）→干燥→固定(热固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。)无菌操作。

（2）染色（1）初染：将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。（2）媒染：用I2液冲去残水，再用I2液覆盖1分钟后，水洗。（3）脱色：①用滤纸吸去残水；②玻片倾斜→95% EtoH脱色（20-30秒）→水洗（洗去紫色）。（5）复染：番红液复染2分钟后，水洗；最后用吸水纸轻轻吸干。

（3）镜检：干燥后（用吸水纸吸干），用油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G )；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。

实验结果：显微镜观察为紫色，所以进葡萄球菌为阳性菌。

四、实验分析

（一）在第一次的选择性培养基中得到的单菌落比较少只有五个不同的菌落，原因应该是在稀释的过程当中对稀释时，上清液中的棉花黄萎病菌数比较少的缘故；在第二次的PDA培养基中我们得到了比较纯的大量的单菌落，例如有青霉菌等，但是经过分析及其菌落的形态观察得出这些培养出的菌落当中，没有我们想要得到的棉花黄萎病菌，究其原因可能是所取土壤样品中棉花黄萎病菌比较少，或者是在第一次的培养基上这种病菌还未长出来，还有就是第二次培养取样时它和其他的杂菌混合了，而没有接种出来。

（二）菌株形态学：在第一次的培养基培养出的菌落全部都是呈圆形或是椭圆形的，纯白色，有纤毛，呈绒毛状；第二次的培养基培养出的菌落有呈青色圆形的，泛黄色的椭圆形的，中间为金黄色周边为白色的圆形菌落，还有中间为黑色，周围是白色的椭圆菌。

我们对青霉菌进行了显微镜下观察：

五、总结与体会