小鼠骨髓染色体实验报告

生命与环境科学学院实验报告

实验课名称遗传学实验实验名称小鼠骨髓细胞染色体的制备与观察成绩______________ 姓名王大锤实验报告系列年级学号组别时间温度

实验原理及目的

实验目的

1、学习小鼠骨髓细胞染色体制片程序；

2、掌握空气干燥法制片方法；

3、观察了解小鼠的端着丝粒染色体的形态。 实验原理

1、染色体标本

制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是其它技术（如显带、原位杂交等）的先决条件。 2、骨髓细胞染色体

染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。动物染色体制备最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。在骨髓细胞中，有丝分裂的指数很高，可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞或其它组织需要经过体外培养。 3、空气干燥法

指细胞经过秋水仙素处理、低渗处理、充分固定和滴片等步骤之后，使载片在空气中自然干燥的方法。

实验材料、仪器及试剂

仪器：

光学显微镜，2mL 注射器，5号针头，10mL 刻度离心管，吸管，试管，试管架，载玻片，盖片，离心机，光学显微镜，解剖器具（解剖盘，剪子、镊子）。 材料：

小白鼠（Mus musculus 2n=40），体重约18-20g （65-90日龄），雌雄皆可。 试剂及其他：

秋水仙素溶液（100μg ／mL ），2%柠檬酸钠溶液，0.075M KCl ，冰醋酸，甲醇，Giemsa 原液，0.01 M 磷酸缓冲液（PBS ，pH 7.4）

实验步骤

1．预处理

进行秋水仙素处理。取骨髓前3-4h 给小鼠经腹腔注入秋水仙素（100μg ／mL ）0.3-0.4mL 。 2．取骨髓

处死动物，立即取后肢骨。用剪刀剪掉、清除腿部的皮肤和肌肉，然后从股骨两端关节头处剪下股骨，立即用2%柠檬酸钠溶液冲洗干净。剪掉股骨两端膨大的关节头，使其露出骨髓腔，用吸有适当量的柠檬酸钠溶液注射器，从一端插入注射针头，将骨髓吹入10mL 刻度离心管中，可反复吹洗数次，直至股骨变白为止。此时离心管中的细胞悬浮液可达4～6mL 。 3．低渗处理

将所获得的细胞悬浮液经1500rpm 离心10min ，吸去上清液；加0.075M KCl 6～8 mL ，立即将细胞团吹散打匀。室温下静止15 min 。 4．固定

低渗处理后的细胞，立即经1500rpm 离心10 min 。吸去上清液，沿管壁加7 mL 3：1甲醇冰醋酸固定液，马上吹散细胞团，使其在固定液中悬浮均匀。静止固定40 min 。离心后弃去上清液。用1：1甲醇冰醋酸固定液再次固定，20min 后弃去上清液，仅留约约1mL 的细胞团和上清液，摇匀制成细胞悬液。

5．滴片和空气干燥

取事先在冰水中预冷的载玻片，滴1～2滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上，立即用吸管轻轻吹气，使细胞迅速分散。将制片平放或45°斜放，待其自然干燥。 6．染色

取经过空气干燥的染色体制片插入染色缸中，用Giemsa 染液进行染色，将染液用吸管缓缓地加入，不要形成气泡。染色30min 后，用蒸馏水冲洗。 7．观察

①在低倍镜下观察Giemsa 染色之后的中期分裂相的形态。

②在高倍镜下选择分散适度，不重叠的染色体的分裂相，在油镜下进行观察，获取图像。 ③观察小鼠染色体的端着丝点染色体的特征，识别着丝点、染色单体、染色体。 ④计算2n 的染色体数目。寻找两性之间在核型上的差别。

预处理

去骨髓

低渗处理

固定

滴片和空气干燥 染色 观察

a.雄鼠

b.雌鼠

图1小鼠骨髓细胞染色体(1000×)

分析讨论

1.获取不同时期染色体的图像，以图像说明小鼠细胞染色体的基本特征。

如图1，小鼠骨髓细胞染色体形态上多为中部着丝粒染色体，染色体数目2n=40，雄性小鼠有一条染色体略小，即Y染色体。

2.讨论要获得较好的有丝分裂相需要注意哪些问题。

1)秋水仙素的注射：秋水仙素可以使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，这样使得染色体停在中期状态，因此处于细胞分裂中期的细胞在整个分裂期

中占的比例会提升，有利于观察结果。

2)取骨：取骨要取小鼠大腿骨，特别注意取骨后一定要把肌肉除净，否则最后的制片会受到影响，即影响有丝分裂相的观察。

3)低渗处理：低渗液可以使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。进而使得细胞内的中期染色体就能够足够

分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞很快破碎，染色体进一步分散开。如果细

胞低渗处理不够，在细胞从高处掉下也无法摔碎，染色体将难以观察。