薄层色谱法在中药标准研究工作中的应用

薄层色谱法的现代应用与发展

王家葵老师

2010s465 叶良红中药学

自新中国成立以来，中药经历着逐步现代化的发展过程。其中质量控制是中药现代化的关键之一。历次版本的中国药典（ChP）就包含着这一过程的例证。

一、薄层色谱在中药分析中的简单回顾

自20世纪60年代薄层色谱取代纸色谱（纸层析）技术作为一种快速、简单、灵敏的鉴别手段应用于中药材及中成药的鉴别，薄层扫描用于许多中药及中成药的含量测定，并收载于中国药典以来，在控制中药质量方面起到积极的作用，已为中药生产及质量监督管理部门所广泛认同。

在早期的中国药典的版本中，只有简单的化学颜色反应和显微鉴别，总灰分和含水量测量以及总浸出物测定，偶尔有总活性部位的含量测定，比如总生物碱，总黄酮，总皂苷等等。

薄层色谱法鉴别是在1985版中国药典〔一部〕被首次收载的，但由于受到当时可获得的化学对照品的缺乏故仅限于个别的专论中。

对照药材－一个始于中国药典1990版的突破

实践表明化学对照品的缺乏阻碍了TLC鉴别在草药中应用的拓展。甚至一些多数草药共同含有的化学对照品对于质量评价来说是不太重要的。为了解决TLC鉴别中的瓶颈问题，对照药材(Reference Crude Drug; RCD)自1990版中国药典起被引入了TLC鉴别项当中。众所周知，TLC的独一无二的优势是能够提供类似图画的成像使得草药中的成分组成能够整体地被可视化。不同种属的草药产生的TLC图像具有各自的专属性。

二、薄层色谱在我国应用的现状

我们在技术上则一直滞留在初始阶段的状态，逐渐与其他发达国家拉开了距离。

我国大多数实验室依然使用实验室自制薄层板，同时多半使用的是简陋的器材，操作粗放，长期处在“低水平，广覆盖”的状态。

三、薄层色谱在其他国家药典中的应用

80年代后期虽然各国药典逐渐倾向于应用液相色谱技术，但在草药分析领域，薄层色谱仍然广泛地被应用，尤其是欧洲国家。他们在器械、仪器、计算机化、自动化等方面都有快速的发展。

欧洲国家草药分析实验室已放弃了自制薄层板，均改用商品预制板，以避免因不同实验室自制的薄层板质量不一致而结果互有差异。

四、TLC在10版药典的应用

复杂体系的药物（中药、天然药）应用越来越广泛

鉴别↑含量测定↓

中西药对TLC不同要求：

中药→鉴别、限量检查、含量测定、指纹图谱分析

化学药→鉴别、杂质检查

五、10版药典在薄层鉴别收载方面的特点

专属有效的测定方式的重用

1、在已有的薄层鉴别中，增加了专属性更强的药材作对照。与对照品相比，本版药典更强调使用对照药材做鉴别，以增加整体专属性。

2、增加对照品同时作对照，使鉴别更具针对性和专属性对照品和对照药材同时使用，增强专属性，空白不得有干扰

3、将有较好专属性的成分替换专属性不佳的成分

六、10版药典对薄层色谱法修订的重点

强调使用预制板（需特别处理和化学改性用自制板）

规范操作方法与条件参照药典附录

增加系统适用性试验耐用性

单波长与双波长薄层，多用双波长去除背景影响

七、薄层分析方法的验证

1、验证的目的：

证明采用的方法是否适合于相应的检测方法

新建立的检测方法、改变原检测方法等均须验证

验证过程和结果均应记载在标准起草或修订说明中

做出来的没作出来的都写，实验记录要详尽

2、需验证的分析方法

TLC鉴别

TLC限量检查毒剧药，梯度点样

TLCS含量测定

3、应进行的方法学内容

鉴别应进行的方法学内容有耐用性、重现性、专属性。

限度应进行的方法学内容有耐用性、检测限、专属性、重现性。

定量限度应进行的方法学内容有耐用性、准确度、重现性、中间精密度、重复性、专属性、定量限、线性、范围。

4、须验证的方法学概念

专属性（Specificity）

系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性，应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均不得干扰测定

鉴别、限量检查、含量测定等均应考察其专属性

应附代表性图谱，以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方）试验说明方法的专属性。并标明相关成分在图中的位置

耐用性（Robustness）

耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据

开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明

典型的变动因素（薄层色谱法）：不同厂牌的薄层板；点样方式点状带状；薄层展开时温度及相对湿度的变化。

经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。

检测灵敏度

用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一块薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。

分离度

用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。

用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：nR=2（d2-d1）/W1+W2

d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；

d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；

W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。

除另有规定外，分离度应大于1.0。

重复性

同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；需显色后测定的相对标准偏差应不大于5.0%

八、薄层色谱方法研究中应注意的问题

薄层色谱鉴别以处方中药味的检出而拟定的方法，检出的具体对象是某一味药、处方中某一成分或某一类成分。但科学合理的鉴别项目应有良好的专属性、可操作性和重现性，并且方法应简便易行

1、薄层色谱鉴别是专属性较强的鉴别方法，可能情况应采用对照品和对照药材的双重对照

2、对新增的对照品及对照药材应按有关规定进行研究

3、对拟定的鉴别应用另一展开剂进行验证实验

4、使用无法定来源的对照品应依法提供资料

5、对照药材与取样成品中被测药材的量间对应关系

6、对所研究的色谱应以彩色照片作记录

7、薄层点样量建议不要大于15ul,注意调整取样量及供试液制备的浓度

8、超声提取因仪器原因不要大于30分钟。如经实验研究后，一定要用较长时间提取，注意提示间隔时间提取。

9、薄层色谱注意记录实验环境条件如温度湿度