肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶研究进展

肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶研究进展
碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β内酰胺类抗生素, 因其对β内酰胺酶稳定以及毒性低等特点, 已经成为治疗多重耐药菌感染最主要的抗菌药物之一，尤其适用于治疗由产超光谱β内酰胺酶（ESBLs）和\或AmpC 酶细菌所引起的严重感染。

既往临床实验室分离的耐碳青霉烯类抗生素菌株多为假单胞菌和不动杆菌等非发酵菌。

但随着碳青霉烯类药物的广泛使用，耐碳青霉烯类抗生素的泛耐药肠杆菌科细菌的出现也越来越多。

标签：肠杆菌科细菌；碳青霉烯酶；耐药机制；改良Hodge试验；PCR；同源性
由于肠杆菌科细菌是临床上重要的医院感染菌之一，对碳青霉烯类抗菌药物的耐药的泛耐药肠杆菌科细菌的流行给临床抗感染治疗带来了极大困难。

引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的耐药机制主要有高产AmpC酶合并膜孔蛋白缺失、产生了水解碳青霉烯类药物的碳青霉烯酶、青霉素结合蛋白(PBP)的改变、主动外排系统的活跃。

其中碳青霉烯酶的产生是泛耐药菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的主要原因。

碳青霉烯酶是能够明显水解碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺酶，现阶段，已知的碳青霉烯酶主要包括以下四种，即Ambler分子分类A-D类。

其中A、D类均属于丝氨酸酶，属于Bush分群中的第2f和2d亚组，B类主要由金属酶过程，属于bush分群中的第3a组。

在肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶主要是A类酶和B类酶, 到目前为止，依据临床实验室耐药菌株的监测数据和文献报道，以KPC酶最为多见，在我国，以上海、浙江等地发现较早、较多，并且出现了发生局部性的流行的趋势。

D类酶（OXA），在肠杆菌科细菌中极为少见，主要由不动杆菌属中检出。

碳青霉烯酶编码基因的具有较高的应用价值，它不仅能够确定对基因元件中的移动质粒进行固定，发挥其在菌种的传播作用，还能够在染色体的辅助下，控制细菌间的传播[1，8]。

1碳青霉烯酶的分类
1.1 A类碳青霉烯酶A类碳青霉烯酶为丝氨酸酶，其中含有丝氨酸结构，属于Bush分群中的第2f亚组，这类酶都是青霉素酶，他们对亚胺培南的水解活性进行分析时，发现他明显强于美罗培南，且还能促使青霉素类、碳青霉烯类等药物产生耐药性作用，而对第3代头孢菌素通常敏感。

他唑巴坦、克拉维酸能够降低此类的活性，但不被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。

不水解第3代头孢菌素。

其中由质粒介导的KPC酶易于在不同菌种中传播，已成为肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类抗生素的主要原因之一。

自2001年在美国北卡罗来纳州肺炎克雷伯菌中发现由质粒介导的碳青霉烯酶KPC-l[1]，2004年纽约州质粒介导的KPC-3肺炎克雷伯菌引起的医院感染之后[2]。

KPC类碳青霉烯酶在全球的检出率逐年升高，美国的纽约州和新泽西州曾一度出现产KPC类碳青霉烯酶耐药菌株的流行[3,4]。

2004年浙江大学医学院附属第一医院首次在临床分离到了产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌之后[5],在我国上
海、浙江等地也曾报道了KPC类碳青霉烯酶个别亚型的局部流行。

KPC类碳青霉烯酶主要为质粒介导，头孢菌素类、碳青霉烯类以及氨曲南等抗生素会出现水解作用，且克拉维酸会明显降低KPC酶的活性[1]。

相关研究显示，在肺炎克雷伯菌中并未检测出KPC酶的存在，但是在肠杆菌科中其他菌种中均可检测出不同数量的KPC酶的各种亚型，包括: 肺炎克雷伯菌的KPC-2[6]、KPC-3（质粒介导）、肺炎克雷伯菌GES-4（Ⅰ类整合子介导）[7]、阴沟肠杆菌NMC-A[8]和IMI-1[9]、粘质沙雷菌SME-1、SME-2、SME-3[10]、大肠埃希菌GES-3等。

目前国内外研究已发现10种KPC亚型[1,2,6]（KPC-1～KPC10），其中KPC-2检出率最高。

1.2 B类碳青霉烯酶B类碳青霉烯酶为金属酶，属于Bush分群中的第3a组。

其活性位点有Zn2+，其催化活性依赖Zn2+，因此又称为金属β一内酰瞎酶。

其水解底物包括青霉素娄、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素，对安曲南类则不会产生水解作用，表现为产酶菌株对临床常用抗菌药物的广泛耐药。

受到EDTA等金属螯合剂的影响，加入Zn2+后能重新促使其发展，此时受他唑巴坦、舒巴坦的影响较小，相反受大多数由整合子等对其的影响会明显增大[11]。

近年来，在肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等菌种中也有发现。

1.3 D类碳青霉烯酶D类碳青霉烯酶主要流行于不动杆菌属中，其在不动杆菌属中的亚型也已多达60多种。

但是D 类碳青霉烯酶在肠杆菌科细菌中却极少被发现和报道，目前在肠杆菌科中发现的D类碳青霉烯酶为来自肺炎克雷伯菌的OXA-48[10]，其对亚胺培南有较高的水解活性，与其他OXA类碳青霉烯酶的同源性仅为46%。

2碳青霉烯酶的检测方法
临床试验室常用的检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的筛选方法有改良Hodge试验（MHT）、金属酶的EDTA检测方法，这两种检测方法有简便、易操作、易判读结果的优点。

依据2009年版CLSI建议，对MIC增高或纸片法抑菌圈缩小的碳青霉烯类抗生素敏感肠杆菌科细菌，采用改良Hodge试验（MHT）检测碳青霉烯酶，这一检测方式的敏感度和特异度均≥90%。

改良Hodge试验（MHT）检测方法为：在无菌生理盐水中准备0.5麦氏标准浊度的大肠埃希菌ATCC25922（指示菌），用无菌生理盐水稀释10倍，按常规药敏实验度将该细菌接种至直径为90mm的MH平板，在常温下放置5min左右，并将美罗培南药敏纸片（10ug）置入平板中心位置。

于平板上取20mm的纵向切口，并在无菌接种环的辅助下提取血板中的待测菌，并接种中介的菌株。

于35℃恒温下孵育20h，并对细菌接种情况进行观察，若划线与抑菌圈交叉位置的细菌呈失状增强生长（典型为苹果蒂样生长）则提示检查结果为阳性，否则为阴性。

有文献报道，用厄他培南作为实验底物时改良Hodge试验（MHT）的敏感性大于90％；用亚胺培南和美罗培南作为实验底物，其敏感性均较低，但亚胺培南和美罗培南作为实验底物时的特异性比厄他培南高[19]。

由于不同种类碳青霉烯酶对药物的水解作用有所差异，所以针对不同种类碳青霉烯酶的检测也有不同的侧重点。

例如：KPC酶对超广谱头孢菌素有水解作用，因此对头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟等头孢类抗生素耐药的菌株应注意检测KPC酶；改良Hodge试验（MHT）所检
测的菌株为底表达金属酶菌株时，灵敏度会降低，会出现假阴性结果。

此时，可采用Lee等的Hodge试验（MHT）改进方法[16]，即在药敏纸片上添加10ul50mmol/L的ZnSO4或在MH平板中加入ZnSO4使最终浓度达到70ug/ml，由于Zn2+存在可以提高金属酶的活性，此时改良Hodge试验（MHT）的敏感性和特异性均＞95。

金属酶的检测，Lee等报道指出，抑制剂增效实验是行金属酶检测的有效方式之一[6]。

进行实验操作期间可先将0.5mmol/LEDTA钠盐溶液注入亚胺培南纸片（每片中加入EDTA约为750ug），并对其纸片进行分析，比对加入EDTA情况对抑菌圈的影响，并根据其检查结果来判断待测菌株是否产生金属酶，如果加EDTA后抑菌圈直径增大7mm及以上时判定为产金属酶。

3产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌感染的治疗
临床研究表明，产碳青霉烯酶细菌的耐药性具有复杂性的特点，且该菌株还会产生AmpC酶、ESBLs，并与其他耐药机制相互影响，如外膜通透性增加、药物作用位点改变、主动外排系统的活跃等，使得临床抗菌药物的选择更加困难。

目前，当人们感染该类细菌时，临床并无治疗该感染的特效药物，用药治疗期间，往往先对患者的细菌耐药性进行分析，再确定治疗方案。

必要时采用抗生素的联合应用。

去除感染危险因素，尽量减少对患者的侵袭性操作。

及时拨出导管、引流管等。

参考文献：
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[2]Woodford N, Tierno P J, Young K, et al. Outbreak of Klebsiella pneumoniae producing a new carbapenem-hydrolyzing class A beta-lactamase, KPC-3, in aNew York Medical Center.[J].Antimicrob Agents Chemother, 2004,48(12):4793-4799.
[3]Bratu S, Mooty M, Nichani S, et al. Emergence of KPC-possessing Klebsiellapneumoniae in Brooklyn, New York: epidemiology and recommendations for detection.[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(7):3018-3020.
[4]Bratu S, Landman D, Haag R, et al. Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in New York City: a new threat to our antibiotic armamentarium.[J]. Arch Intern Med,2005,165(12):1430-1435.
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