血清总补体溶活性测定-36页PPT精选文档

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1：20血清ml
0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 --
BB液 ml
1.4 1.35 1.3 1.25 1.2 1.15 1.1 1.05 1.0 1.5
溶血素ml（2U/ml）
每管加入0.5
2%SRBCml
每管加入0.5
聚合IgG、SPA、dDNA
识别阶段 识别单位：C1q、C1r、C1s
活化阶段 活化单位：C4、C2、C3
膜攻击阶段 膜攻击单位：C5~C9
IgG 分 子 结 合 抗 原 前 后 的 构 象 变 化
结合抗原之前
结合抗原之后
Fc段
CH1
C1q 结合
CH2
位点被屏
障
暴露的 C1q结 合位点
IgM CH3区，IgG CH2区
• (2)用缓冲液配制成2% (200ulRBC+10ml缓冲液)
• 2、 1：20稀释血清： 300ul血清+6mlBB 液(已稀释)
• 3、稀释巴比妥缓冲液：4mlBB原液 +20ml水，1：5稀释(已稀释)
• 4、 2u/ml溶血素: 用溶血素1 ml + 2000 ml BB液稀释(已稀释)
•调控成分 •补体受体
CT抑制物（CT INH） C4结合蛋白（C4bp） I因子（C3b INA） H因子（C3b INA促进因子） （1H） SC蛋R1白（CD35）、CR2（CD21）
CR3（CD11b/CD18）
CR4（CD11c /CD18）等
经典途径激活(classical pathway) 激活物质 抗原抗体复合物（Ag - Ab）、
补体介导的溶解技术
• 血清补体总活性测定（CH50试验）
试验方法
1、绵羊红细胞 抽绵羊全血→去纤维 →用NS洗涤三次→用缓冲液配制成2% 备用。
绵羊红细胞的制备法
2、溶血素 即抗绵羊红细胞抗体， 是以SRBC免疫家兔而得到的兔血 清。但试验前应进行加热 56℃30min以灭活补体。 （1）溶血素稀释 根据需要对其 进行稀释。补体活性测定一般使用 2U(1：2000)
Who are you ?
C1
补体攻膜单位
细胞膜表面的C3b5b 与C6、C7、C8依次结合 形成C5b678复合物。该 复和物诱发C9在细胞膜 表面共聚，形成膜表面 的通道结构MACs，造成 胞膜的穿孔损伤。
C5b+C6+C7+ACs 造成的细胞膜损伤
有效反应管，以该管中所含溶血素的量为 1U/ml,以该管的溶血素稀释倍数为溶血素的 效价。如上表中溶血素的效价应为 1：4000。
3、稀释缓冲液：PH7.2-7.4磷酸盐缓冲液或 巴比妥缓冲液加NaCl以保持等渗，加适量 活化补体不可少的Ca2+和Mg2+ 4、补体： 取新鲜血清标本，1：20稀释 血清。
正常情况下，补体在体内以无活性酶 原形式存在，须经激活后才能发挥其
功能
补体系统按其性质与功能分三类
• 1补体系统固有成分，共九种，C1-----C9 . • 2调节和控制补体系统活化的成分
• 3补体受体(CR)
一、补体的组成和命名
•固有成份 C1 ~ C9 （ C1q C1r C1s） B因子，D因子，P因子
50%溶血标准管
• 5、 取2%SRBC悬液0.25ml加1ml蒸馏水 使 SRBC完全溶解，为100%溶血。
• 再加入1.8%NaCL溶液 1ml校正为等渗溶 液，最后加入2%SRBC悬液0.25ml ，即 为50%溶血悬液
取试管10支，分别编号1、2、3……10，按下表加入物质：
CH50测定操作表
C6 C7
C5b C8
C9多 聚体
补体参与的溶血反应
溶血反应是指补体参与的抗体致 敏红细胞的溶解反应. 参与反应的成分有（1）红细胞； （2）抗红细胞抗体，也称溶血素； （3）补体
•
补体参与的溶血试验
•
溶血试验 是将抗红细胞的抗体(通常称为溶血素)与
相应的红细胞混合，当补体存在时，红细胞即被溶解。
血清总补体溶血活性测定
以溶血百分率为纵坐标，相应补体血清量为横 坐标，在一个稳定的体系中，溶血程度与补体 剂量呈一种特殊的“S”形曲线。曲线在30%70%之间最陡几乎呈直线，补体剂量的少许变 化，溶血程度会发生很大改变，曲线此阶段对 补体量的变化非常敏感，所以试验常以50%溶 血作为终点指标，该试验即为50%补体溶血试 验。
思考题
• 补体C3降低的临床意义？为什么要选用 50%的致敏羊RBC溶血作为试验的终点？
血清总补体溶血活性测定（CH50 试验）
补 体 (Complement)
补体----是一组存在于人和 脊椎动物血清及组织液中 具有酶样活性、不耐热和 功能上连续反应的 糖蛋白， 是抗体发挥溶细胞作用的 必要补充条件。
Jules Bodet (1870-1961), Discoverer of complement
摇匀、37℃水浴30min，取出离心2500r/min×5min
• 6、比色
• 肉眼观察：初步目视比较，找出与标准 管相近的两管
• 比色：在分光光度计上读取OD541值,测 定与50%溶血标准管最近的一管为最高 有效反应管。
按下列公式求50%溶血的总补体值
CH50（U/ml）＝
1 血清用量
X 稀释倍数
总补体活性参考范围： 50~100U/ml
方法学评价
CH50试验测定经典途径总补体溶血活性， 所反应的是补体9种成分的综合水平。
本法敏感性较低，补体的溶血活性除与试验 中反应体积有关外，还与反应所用缓冲液的PH、 离子强度、钙镁浓度、SRBC数量和反应温度有 一定关系故实验时对反应的各个环节应严格控制， 统一步骤。
正常人血清中的补体活性及含量相对稳定， 在疾病情况下补体水平可能出现波动。 因此对补体活性及含量的检测有助于某 些疾病的诊断、疗效观察和发病机制研 究。
临床意义
• 1、增高：急性炎症，组织损伤，恶性肿瘤 • 2、降低 ： • 主要见于消耗增加： • 急性肾小球肾炎、SLE活动期、类风湿关节炎
、急性乙型肝炎、慢性肝炎、自身免疫病活动 期等有明显的补体下降。 • 分解加速或合成不足：严重肝病、肝硬化、营 养不良。 • 严重肝病时，肝坏死，CH50降低，甚至为0， 对判断肝受损程度有临床意义
效价滴定
溶血素的滴定
管 号
溶血素 稀释度
溶血素
1：60 的补体
1 1：1000 0.1 0.2
2 1：2000 0.1 0.2
3 1：3000 0.1 0.2
4 1：4000 0.1 0.2
5 1：5000 0.1 0.2
6 1：6000 0.1 0.2
7 1：8000 0.1 0.2
8 1：10000 0.1 0.2
9 （对照） -- --
缓冲液
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.5
2% SRBC
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
结果
全溶 全溶 全溶 全溶 大部分溶 微溶 不溶 不溶 不溶
溶血素效价和单位的确定：
以产生完全溶血的最高稀释管为最大
此种特异性溶血现象肉眼可见，广泛用于血清总补体
活性测定。此外，溶血试验常用于补体结合试验中作
为指示系统。
溶血反应的用途
• 1、测定总补体活性 • 2、补体结合试验，即利用溶血系统作为
指示剂，检测另一个反应系统的抗原或 抗体。
血清总补体溶血活性测定
试验原理：血清补体的主要活性是溶细胞作用。 红细胞与特异性抗体结合后可激活补体,导致红 细胞溶解。补体的活性与溶血程度相关，但不 是直线关系。
5、50%溶血标准管 取2%SRBC悬液0.25ml加蒸馏水1ml， SRBC全部溶解，为100%全溶血。再加 1.8%NaCL1mL,最后加2%SRBC悬液0.25ml
混匀，即为50%溶血标准管。
试验方法
• 1、配制2%绵羊红细胞
• (1) 1ml绵羊红细胞+5ml生理盐水 →2000rpm*5分钟→重复洗涤三次 →